共焦点顕微鏡と通常の光学顕微鏡の比較
一般的な光学顕微鏡
一般的な生物顕微鏡は、次の 3 つの部分で構成されます。 ① 光源とコンデンサーを含む照明システム。 ② 対物レンズと接眼レンズからなる光増幅システムは顕微鏡の本体です。 球面収差と色収差を除去するために、接眼レンズと対物レンズは両方とも複雑なレンズ群で構成されています。 (3) 材料の固定や観察に便利な機械装置。
顕微鏡画像が鮮明かどうかは、倍率だけでなく、顕微鏡の解像度にも依存します。 解像度とは、顕微鏡 (または人間の目が対象物から 25cm 離れた場所) で物体の小さな間隔を識別できる能力を指します。 解像度は光の波長、開口率、媒質の屈折率に依存し、次の式で表されます。
R=0.61λ /N． N．A．＝ｎsin /2
ここで: n= 媒質の屈折率。=ミラー角度 (レンズ開口部に対する試料の開口角)、および NA= 開口数。 ミラーの角度は常に 180 未満ですか? したがって、sina/2 の zui 値は 1 未満でなければなりません。
光学レンズに使用されるガラスの屈折率は1.65～1.78であり、使用する媒質の屈折率はガラスの屈折率に近いほど良いとされています。 乾式対物レンズの場合、媒体は空気であり、開口率は一般に 0 です。05 ~ 0.95; オイルレンズは芳香性アスファルトを媒体としており、レンズ開口率を1.5に近づけることができます。
通常の光の波長は400〜700nmであるため、顕微鏡の解像度は0.2μm以上であり、人間の目の解像度は0.2mmであるため、zuiが設計した大きな倍率は一般的な顕微鏡は通常1000倍です。
なぜ共焦点顕微鏡が必要なのでしょうか?
1. 光学顕微鏡は偉大な先人の努力と改良によって完成されました。 実際、通常の顕微鏡は、簡単かつ迅速に美しい顕微鏡画像を提供します。 しかし、このほぼ完璧な顕微鏡の世界に革命をもたらす出来事が起こりました。それが「レーザー走査型共焦点顕微鏡」の発明です。 この新しい顕微鏡の特徴は、焦点が集中している面の画像情報のみを抽出する光学系を採用し、焦点を変えながら取得した情報を画像メモリに復元することで、完全な三次元情報を持った鮮明な画像を得ることができることです。取得できる。 この方法により、通常の顕微鏡では確認できない表面形状の情報を簡単に得ることができます。 また、通常の光学顕微鏡では、特に高倍率において「解像度の向上」と「焦点深度の深さ」が相反する条件でしたが、共焦点顕微鏡ではこの問題が解決されます。
2. 共焦点光学系のメリット
共焦点光学系がサンプル点を照明し、その反射光も点受光器で受光されます。 試料が焦点位置にある場合、反射光はほとんどすべて受光素子に到達しますが、試料が焦点から外れると反射光は受光素子に到達できなくなります。 つまり、共焦点光学系では焦点に合った像のみが出力され、白斑や無駄な散乱光は遮断される。
3. なぜレーザーを使用するのですか?
共焦点光学系では、サンプルが照明され、その反射光も点受光器で受光されます。 したがって、点光源が必要となる。 レーザーは非常に点光源に属します。 共焦点顕微鏡の光源にはレーザー光源が採用されることがほとんどです。 また、単色性、指向性、優れたビーム形状などのレーザーの特性も広く使用される重要な理由です。
4. 高速スキャンによるリアルタイム観察が可能になります。
レーザー走査には水平方向に音響光偏向器（AOプライム素子）、垂直方向にサーボガルバノミラーを使用します。 音響光偏向部には機械的な振動部分がないため、高速走査が可能であり、モニタリング画面上でリアルタイム観察が可能です。 このカメラの高速性は、フォーカスと位置検索の速度に直接影響する非常に重要なプロジェクトです。
5. ピント位置と明るさの関係
共焦点光学系では、試料が焦点位置に正しく配置されているときは輝度が高く、その前後では輝度が急激に低下します（図4実線）。 この焦点面の敏感な選択性は、共焦点顕微鏡の高さ方向を測定し、焦点深度を拡大する原理でもあります。 対照的に、通常の光学顕微鏡では、焦点位置の前後で明らかな明るさの変化はありません（図4の点線）。
6. 高コントラスト・高解像度
一般的な光学顕微鏡では焦点から外れた反射光が干渉し、焦点結像部分と重なって画像のコントラストが低下します。 これに対し、共焦点光学系では焦点外の散乱光と対物レンズ内の散乱光がほぼ完全に除去されるため、非常にコントラストの高い画像が得られます。 また、光が対物レンズを2回通過するため、まず点像が鮮明になり、顕微鏡の解像度も向上します。
7. 光学定位機能
共焦点光学系では、焦点以外の部分の反射光は微細孔によって遮られます。 したがって、立体的な試料を観察すると、焦点を合わせて試料をスライスしたような像が形成されます（図5）。 この効果は光学的局在化と呼ばれ、共焦点光学系の特徴の 1 つに属します。
8. フォーカス移動メモリー機能
焦点の外側のいわゆる反射光は、微細孔によって遮られます。 一方、共焦点光学系により結像される像上の全ての点が焦点と一致すると考えることができる。 したがって、三次元サンプルをZ軸（光軸）方向に沿って移動すると、画像はメモリに蓄積されて保存され、最終的にサンプル全体と焦点の一致によって形成された画像が得られます。 。 このように焦点深度が無限大になる機能をモバイルメモリー機能と呼びます。
9. 表面形状測定機能
フォーカス移動機能では、高さ記録ループを追加することで、非接触で試料の表面形状を測定することができます。 この機能により、zuiの大きな輝度値が形成するZ軸座標を各画素に記録することができ、この情報に基づいて試料の表面形状に関する情報を得ることができる。
10. 高精度微小サイズ測定機能
受光部には1次元CCDイメージセンサーを採用しているため、走査装置の走査傾きの影響を受けず、高精度な測定が可能です。 また、焦点深度を調整できるフォーカス移動メモリー機能も同時に採用しているため、フォーカスオフセットによる測定誤差を排除できます。
11. 三次元画像解析
表面形状測定機能を使用すると、試料表面の三次元画像を簡単に作成できます。 それだけでなく、表面粗さ測定、面積、体積、表面積、真円度、半径、瑞の長さ、周長、重心、断層像、FFT変換、直線などの多彩な解析が可能です。幅の計測など。
レーザー共焦点走査型顕微鏡は、細胞の形態観察だけでなく、細胞内の生化学成分の定量分析、光学密度統計、細胞形態測定にも使用できます。
