共焦点顕微鏡の開発動向
共焦点顕微鏡では、技術レベルでより良い観察結果を得るために、解像度の向上、光毒性の低減、走査速度の高速化、厚い試料の観察、生体内観察などの技術レベルの向上に注力しています。 現状ではZ有効です。 共焦点顕微鏡技術で Zda を推進するのは、光学限界を突破し、研究者がより微細な細胞構造を取得できるようにする超高解像度顕微鏡です。これは、研究者が生命活動をより深く理解するのに役立ちます。 共焦点顕微鏡技術の次の研究の焦点は、次の点に焦点を当てる必要があります。
1. スキャン速度の高速化
現在、共焦点走査速度は走査装置の機械的構造によって制限されており、より速い走査速度を得るには解像度を犠牲にするしかありません。 多くの生物学的プロセスは非常に速いため、検出できないままです。
2. より完成度の高い超高解像度技術
現在、超高分解能技術にはSTORM、PALM、STED、SSIMなどがあり、分解能は20～200nmの範囲にありますが、各技術にはサンプル処理、Z軸方向、光毒性などの一定の欠点があります。ほぼ完璧ではなく、実際の観察では限界分解能を達成することが困難なことがよくあります。
3. 互換性の強化
共焦点顕微鏡技術には、前述の多光子観察やライトシート観察などのさまざまな励起方法が含まれており、コヒーレントアンチストークスラマン散乱は理論的には一連のレーザーシステムを共有できます。 超解像度顕微鏡は白色レーザー技術と組み合わせることができます。 しかし、各社の特許問題により、完成度や互換性の点でまだ改善の余地があり、現状の機器ではアプリケーションの技術的利点を十分に発揮することができません。
共焦点顕微鏡の原理
共焦点顕微鏡は、顕微鏡光学系、レーザー光源、スキャナー、検出・処理系の4つの部分から構成されています。 光源にはコヒーレンスの良いレーザーを使用しています。 従来の光学顕微鏡に基づいた共役集束原理と装置を採用し、画像処理にはコンピュータによる観察、分析、出力システムを一組として使用します。
レーザー走査ビームは回折格子のピンホールを通過して点光源を形成し、ビームスプリッターを通って対物レンズに反射され、試料上に焦点を合わせて走査されます。 試料励起後、発生した蛍光は分光器に戻り検出ピンホールに集められ、光電子増倍管で電気信号に変換されてコンピュータに送信され、鮮明な焦点面像が表示されます。 励起光は回折格子のピンホールを通してサンプルに集束され、蛍光は対物レンズを通してピンホールに集束されます。 このプロセスにより 2 つの焦点が形成されるため、共焦点顕微鏡と呼ばれます。
通常の生体サンプルは複雑な構造をしており、ある程度の厚みを持っています。 通常の蛍光顕微鏡で観察すると、試料から発せられる蛍光が重なり合い、画像の解像度が大幅に低下します。
共焦点顕微鏡の共焦点結像は、焦点面外の迷光や非測定光が検出器に入るのを効果的に抑制し、単焦点面結像を実現し、解像度を大幅に向上させることができます。 ステージが水平方向に均一に移動すると、鮮明な単層画像を形成でき、垂直方向では、異なる深さでサンプルを層ごとに走査し、三次元構造を取得できます。いわゆる「光CT」による三次元再構成後のサンプル。 サンプルを蛍光プローブで標識し、共焦点顕微鏡で観察します。 さまざまな固定細胞や組織構造の観察だけでなく、生きた細胞の形態や構造、イオンなどを定性的・定量的に観察・測定することができます。
