共焦点レーザー顕微鏡の特徴と応用
レーザー走査型共焦点顕微鏡 (LSCM) は、共役焦点技術に基づいて設計された顕微鏡の一種です。つまり、レーザー光源、テスト対象のサンプル、および検出器をすべて相互に共役位置に配置します。
基本的
一般的な顕微鏡では、対物レンズの焦点面が検出器と一致するため、観察される像面は隣接する軸面から分離されますが、共焦点顕微鏡では、回折限界の光スポットを使用してサンプルが照明され、この分離効果は、スポット共役体の焦点における集光光路内のピンホールを使用して迷光をフィルタリングし、解像度を向上させることによって達成されます。
イメージング機能
共役サンプル層から反射された光だけが収集光路の小さな穴を通過でき、残りの無関係なサンプル層の反射は小さな穴によってブロックされます。 これにより、解像度が大幅に向上する可能性があります。 以下に示すのは、同じ厚いサンプルの多次元蛍光顕微鏡検査と共焦点顕微鏡検査を並べて比較したものです。 一連の画像が異なる焦点面で撮影されると、一般に「Z スタック」と呼ばれるものが生成される可能性があります。この画像は、共焦点顕微鏡によってもたらされる解像度とコントラストの向上と、これらの向上の根本的な原因の両方を示しています。 組織の上の結像面でスタックの最上部の画像を調べると、蛍光画像には多くの散乱光が見られますが、共焦点画像は黒く見えます。 この軸方向の PSF の減少は、Z スタックの中央の光学界面で観察される解像度の違いに直接関与します。
レーザー走査型共焦点顕微鏡のもう 1 つの特徴は、走査型イメージング技術であることです。 従来の広視野照明技術はサンプル全体を照らすため、肉眼または検出器で画像を直接キャプチャできますが、LSCM ではスキャンとイメージングのためにサンプルを通過するビームまたは複数の集束ビームが使用され、結果として得られる画像は次のようになります。光学部といいます。 従来の広視野照明法とレーザー走査型共焦点照明法の違いを以下に示します。
したがって、最新の共焦点顕微鏡の実際の作業方法を次の図に示します。 レーザーから発せられた励起光はダイクロイックミラーを通過し、一対の振動ミラーを通してサンプルのx方向とy方向に走査します。 サンプルの励起（または反射） 光はピンホールを通って PMT 検出器に入射して記録され、記録された走査画像はコンピューターによって再構成されて実際のサンプル画像が得られます。
