レーザー共焦点顕微鏡の特徴と用途
通常の顕微鏡では、対物レンズの焦点面を検出器と重ね合わせることで、観察像面を隣接する軸面から分離しますが、共焦点顕微鏡では、回折限界の光線でサンプルを照射し、この光線の共役焦点で集められた光の経路にピンホールを使用して迷光をフィルタリングすることで分離が達成され、解像度が向上します。
共役サンプル層から反射された光だけが集光路のピンホールを通過でき、残りの無関係なサンプル層の反射はピンホールによってブロックされます。これにより、解像度が大幅に向上します。以下は、同じ厚いサンプルの多次元蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡を並べて比較したものです。一連の画像が異なる焦点面で撮影されると、一般に「Z スタック」と呼ばれる画像が生成されます。この画像には、共焦点顕微鏡によって得られる解像度とコントラストの向上と、これらの向上の根本的な理由が示されています。スタックの最上部、つまり画像面が組織の上にある画像を調べると、蛍光画像に大量の散乱光があることがわかりますが、共焦点顕微鏡画像は黒く見えます。この軸方向の PSF の減少は、Z スタックの中央の光学インターフェイスで観察される解像度の違いに直接影響します。
光学スライススキャン画像
レーザー走査型共焦点顕微鏡のもう 1 つの特徴は、走査型イメージング技術であることです。従来の広視野照明技術では、サンプル全体を照らして、肉眼または検出器で画像を直接キャプチャできますが、LSCM では 1 つ以上の集束した光線を使用してサンプルをスキャンするため、次の図に示すように、結果として得られる画像は光学スライスと呼ばれます。従来の広視野照明とレーザー走査型共焦点照明の違いを以下に示します。
そのため、現代の共焦点顕微鏡の実用的な方法は、下の図に示されています。レーザーからの励起光は、ダイクロイックミラーを通過し、サンプルの x 方向と y 方向に一対のガルバノミラーを介してスキャンされ、サンプルの励起 (または反射) はピンホールを通過して PMT 検出器に記録され、記録されたスキャン画像はコンピューターによって再構成され、サンプルの実際の画像が生成されます。
