多光子顕微鏡イメージング: 生体内ニューロンをイメージングするための多様な技術
従来の単一光子広視野蛍光顕微鏡と比較して、多光子顕微鏡 (MPM) は光学的セクショニングとディープイメージングの機能を備えています。 2019年、ジェローム・ルコックら。 脳深部ニューロンイメージング、大規模ニューロンイメージング、および高速ニューロンイメージングの 3 つの側面から、関連する MPM テクノロジーについて説明しました。
ニューロンの活動と複雑な行動を結び付けるには、通常、皮質深部のニューロンを画像化する必要があり、MPM には深層画像化の能力が必要です。 励起光と発光光は生体組織によって高度に散乱および吸収されます。これが、MPM のイメージング深度を制限する主な要因となります。 散乱の問題はレーザー強度を高めることで解決できますが、サンプルの焼け、焦点ぼけ、表面近くの蛍光励起などの他の問題が発生します。 MPM イメージングの深度を高める最良の方法は、励起光としてより長い波長を使用することです。
さらに、2 光子 (2P) イメージングでは、焦点外れと表面近くの蛍光励起が 2 つの最大の深度制限要因ですが、3 光子 (3P) イメージングでは、これら 2 つの問題は大幅に軽減されますが、蛍光による 3 光子イメージング グループの吸収断面積は 2P の吸収断面積よりもはるかに小さいため、2P によって励起されたものと同じ強度の蛍光シグナルを取得するには、1 桁高いパルス エネルギーが必要です。 機能的 3P 顕微鏡法は構造的 3P 顕微鏡法よりも要求が厳しく、時間内に神経活動をサンプリングするためにより高速なスキャンが必要です。 各ピクセルの滞留時間内に十分な信号を収集するには、より高いパルスエネルギーが必要です。
複雑な行動には、ローカル接続と長距離接続の両方を備えた大規模な脳ネットワークが関与することがよくあります。 ニューロンの活動を行動と結び付けるには、非常に大きく広範囲に分布するニューロンの活動を同時に監視する必要があります。 脳内の神経ネットワークは、入ってくる刺激を数十ミリ秒以内に処理します。 この高速ニューラル ネットワークを理解するには ニューロンのダイナミクスを研究するには、MPM にニューロンを迅速に画像化する機能が必要です。 高速 MPM 方法は、シングル ビーム スキャン技術とマルチ ビーム スキャン技術に分類できます。
シングルビームスキャン技術により、広い視野 (FOV) での神経組織の高速横断が可能になります。
MPM を使用してニューロンをイメージングする場合、ランダム アクセス スキャン (つまり、レーザー ビームが視野全体の選択した点ですばやくスキャンされます) では、目的のニューロンのみをスキャンできます。これにより、ラベルのない神経線維のスキャンが回避されるだけでなく、レーザービームの走査時間も最適化します。 ランダム アクセス スキャン (図 1) は、高周波信号を備えた圧電トランスデューサーを適切な結晶に結合することによって機能する音響光学偏向器 (AOD) を使用して実現できます。 結果として生じる音響波は、周期的な屈折率格子を誘発します。レーザービームが格子を通過するときに回折が発生します。 高周波電気信号により音波の強度と周波数を調整し、回折光の強度と方向を変えることができるため、1台のAODで1次元水平任意点走査を実現し、3Dを実現することができる他のアキシャル スキャン技術と組み合わせた 1 対の AOD を使用することにより、ランダム アクセス スキャンが可能になります。 ただし、この技術はサンプルの動きに非常に敏感であり、動きアーチファクトが発生しやすいです。 現在、アルゴリズムがモーションアーチファクトを容易に解決できるため、高速ラスタースキャン、つまりFOVでのプログレッシブスキャンが広く使用されています。
AOD ベースの生体内新皮質 L2/3 ニューロンの 2 光子イメージング[2]
高速ラスター スキャンを実現するには、高速 2D スキャンに振動ミラーを使用する方法、高速 3D スキャンに振動ミラーと調整可能な電動レンズを組み合わせる方法など、さまざまな方法がありますが、調整可能な電動レンズは、次のような制限があるため、軸方向に迅速に焦点を合わせることができません。イメージング速度に影響を与える機械的慣性スイッチングを、空間光変調器 (SLM) で置き換えることができるようになりました。
図 2 に示すように、リモート フォーカシングも 3D イメージングを実現する手段です。LSU モジュールでは、走査検流計が水平方向に走査し、ASU モジュールには対物レンズ L1 とミラー M が含まれており、軸方向の走査は調整によって実現されます。この技術は、主対物レンズ L2 によって導入される光学収差を補正できるだけでなく、高速軸方向走査も可能にします。 より多くのニューロンイメージングを取得するには、顕微鏡の対物レンズ設計を調整することで FOV を拡大できますが、大きな NA と大きな FOV を備えた対物レンズは通常重く、高速軸スキャンのために素早く移動できないため、大きな FOV システムはテレフォーカスに依存します。 、SLM および調整可能な電動レンズ。
遠隔集束二光子イメージングシステムの概略図[3] マルチビームスキャン技術により、神経組織の異なる位置を同時にイメージング可能
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm 離れた）画像化部位（図 3C、D）。 隣接する領域の場合、通常、イメージングに単一の対物レンズの複数のビームを使用します（図3E、F）。 マルチビーム走査技術では、励起ビーム間のクロストーク問題に特別な注意を払う必要がありますが、この問題はポスト光源分離法または時空多重化法によって解決できます。 ポストホック光源分離法とは、クロストークを排除するためにビームを分離するアルゴリズムの使用を指します。 時空間多重化方法は、複数の励起ビームを同時に使用することを指し、各ビームのパルスは時間的に遅延されるため、異なるビームによって励起された個々のビームを一時的に分離できます。 蛍光シグナル。 より多くのビームを導入することでより多くのニューロンを画像化できますが、複数のビームを使用すると蛍光減衰時間の重複が増加するため、信号源を区別する能力が制限されます。 そして多重化は電子機器の動作速度に悪影響を及ぼします。 高い要件。 また、多数のビームを使用すると、単一ビームのおおよその信号対雑音比を維持するためにより高いレーザー出力が必要になるため、組織損傷が容易に発生する可能性があります。
大面積イメージング技術
近年、さまざまなMPM技術の開発により、神経組織のイメージングの範囲が広がり、脳の奥深くにあるより多くのニューロンをより高速にイメージングできるようになり、神経科学の研究が大幅に促進され、より明確な理解が得られるようになりました。脳の機能のこと。
