（2光子、共焦点）蛍光顕微鏡と通常の顕微鏡の違い
2光子励起の基本原理は、高光子密度では、蛍光分子が2つの長波長光子を同時に吸収し、いわゆる励起状態の寿命の後に短い波長光子を放出できることです。効果は、蛍光分子を興奮させるために、長波長の波長の半分の光子を使用することと同じです。 2つの光子励起には高い光子密度が必要であり、細胞の損傷を避けるために、2光子顕微鏡検査では高エネルギーモードロックされたパルスレーザーを使用します。このレーザーによって放出されるレーザーは、ピークエネルギーが高く、平均エネルギーが低く、パルス幅は100フェムト秒のみで、最大80〜100メガヘルツの周波数があります。高数値開口目的レンズを使用してパルスレーザーの光子に焦点を合わせると、対物レンズの焦点での光子密度が最高であり、2光子励起は対物レンズの焦点でのみ発生します。したがって、2光子顕微鏡には共焦点ピンホールは必要ありません。これにより、蛍光検出の効率が向上します。
一般的な蛍光現象では、励起光の光子密度が低いため、蛍光分子は一度に1つの光子のみを吸収し、一本光子蛍光として知られる放射転移を通じて別の蛍光光子を放出できます。光源、2光子または多光子蛍光現象としてレーザーを使用した蛍光励起プロセスの場合、発生する可能性があります。この場合、使用される励起光源は、蛍光分子が2つの光子を同時に吸収するための要件を満たす高強度と光子密度を持っています。一般的なレーザーを励起光源として使用する過程で、光子密度は2光子吸収現象を生成するにはまだ不十分です。通常、フェムト秒パルスレーザーが使用され、瞬時の出力はメガワットレベルに達します。したがって、2光子蛍光の波長は励起光の波長よりも短く、半分の励起波長励起によって生成される効果に相当します。
共焦点蛍光顕微鏡に関連する知識
共焦点蛍光顕微鏡の基本原理は、点光源を使用して標本を照射し、焦点面に明確に定義された小さな光スポットを形成することです。照射後にこのスポットから放出される蛍光は、対物レンズによって収集され、元の照射経路に沿って二角膜鏡で構成されるビームスプリッターへと送り返されます。分光計は、蛍光を検出器に直接送ります。光源と検出器の両方の前にピンホールがあり、それぞれ照明ピンホールと検出ピンホールと呼ばれます。 2つの幾何学的寸法は一貫しており、約100-200 nm;焦点面のライトスポットと比較して、2つは共役です。つまり、ライトスポットは一連のレンズを通過し、最終的に照明ピンホールと検出ピンホールの両方に同時に焦点を合わせることができます。このようにして、焦点面からの光は検出穴の範囲内に収束することができますが、焦点面の上または下から散乱光が検出穴の外側にブロックされ、画像化できません。レーザーでポイントごとにサンプルポイントをスキャンすると、Pinholeを検出した後の光電子充填チューブは、光のスポットポイントの対応する共焦点画像も取得し、それをデジタル信号に変換し、コンピューターに送信し、最終的に画面上の焦点面全体の明確な共焦点画像に集約します。
