光学顕微鏡の主な観察方法は蛍光観察
蛍光現象
蛍光とは、蛍光物質に特定の波長の光を照射すると、ほぼ同時に長波長の光を発する現象のことです（図1）。 特定の波長 (励起波長) の光が分子 (フルオロフォア内の分子など) に当たると、光子エネルギーが分子の電子に吸収されます。 次に、電子は基底状態 (S0) からより高いエネルギー準位である励起状態 (S1') に遷移します。 この過程を励起①といいます。 電子は 10-9–10-8 秒間励起状態にとどまり、その間に電子はいくらかのエネルギーを失います ②。 励起状態（S1）から基底状態③に戻る過程で、励起過程で吸収した残りのエネルギーが放出されます。
励起状態での蛍光分子の滞留時間は、一般にナノ秒単位の蛍光寿命であり、蛍光分子自体の固有の特性です。 蛍光寿命を利用したイメージング技術は、蛍光寿命イメージング（FLIM）と呼ばれ、蛍光強度イメージングに加えて、より詳細な機能的かつ正確な測定を実行して、分子のコンフォメーション、分子間相互作用、および分子の微小環境を取得できます。 従来の光学イメージングでは得られない情報。
蛍光のもう 1 つの重要な特性は、励起ピークと発光ピークの間の波長の差であるストークス シフトです (図 2)。 通常、放出光の波長は励起光の波長よりも長くなっています。 これは、蛍光物質が励起された後、光子が放出される前に、緩和プロセスによって電子がエネルギーの一部を失うためです。 ストークスシフトが大きい蛍光物質ほど、蛍光顕微鏡で観察しやすくなります。
蛍光顕微鏡と蛍光フィルターブロック
蛍光顕微鏡は、蛍光の性質を利用して観察・画像化する光学顕微鏡で、細胞生物学、神経生物学、植物学、微生物学、病理学、遺伝学などの分野で広く利用されています。 蛍光イメージングは、感度が高く、特異性が高いという利点があり、組織や細胞内の特定のタンパク質や細胞小器官などの分布の観察、共局在と相互作用の研究、生命動態の追跡に非常に適しています。イオン濃度の変化などのプロセス。
細胞内のほとんどの分子は蛍光を発せず、それらを見るためには蛍光標識する必要があります。 蛍光標識には、直接標識する方法 (DAPI を使用して DNA を標識する方法など) や、抗体の抗原結合特性を利用した免疫染色法、または標的タンパク質を蛍光タンパク質 (GFP、緑色など) で標識する方法が多数あります。蛍光タンパク質)、または可逆結合。 合成染料（フラ-2など）など
現在、蛍光顕微鏡は、さまざまな研究室やイメージング プラットフォームの標準的なイメージング機器となっており、日々の実験に役立ちます。 蛍光顕微鏡は主に 3 つのカテゴリに分類されます: 正立蛍光顕微鏡 (セクショニングに適しています)、倒立蛍光顕微鏡 (セクションを考慮して、生きた細胞に適しています)、蛍光実体顕微鏡 (植物、ゼブラフィッシュ (大人/胚）、メダカ、マウス/ラット臓器など）。
蛍光フィルター ブロックは、顕微鏡での蛍光イメージングのコア コンポーネントです。 励起フィルター、発光フィルター、ダイクロイックビームスプリッターで構成されています。 これは、6- ポジション フィルター ホイールを装備したライカ DMi8 などのフィルター ホイールに取り付けられています (図 3)。 ）。 顕微鏡によってホイールの位置が異なり、一部の顕微鏡ではフィルター スライドが使用されます。
フィルター ブロックは、蛍光イメージングにおいて重要な役割を果たします。励起フィルターは、励起光を選択してサンプルを励起し、他の波長の光をブロックします。 励起フィルターを通過した光は、ダイクロイック ビームスプリッターを通過します (その役割は、励起光を反射し、蛍光を透過することです)。反射後、対物レンズによって集光され、サンプルに照射され、対応する蛍光が励起されます。光を放つ。 放出された光は対物レンズによって集光され、ダイクロイックビームスプリッターを通過し、発光フィルターに到達します。 図 4 に示すように、励起波長は 450-490 nm、ダイクロイック ビーム スプリッターは 510 nm より短い光を反射し、510 nm より長い光を透過し、放出光の受光範囲は 520-560 nm です。
蛍光顕微鏡で一般的に使用される蛍光フィルターは、ロングパス（略してLP）とバンドパス（略してBP）の2種類に分けられます。 バンドパスは通常、中心波長と間隔の幅 (480/40 など) によって決まります。これは、460-500 nm からの光が通過できることを意味します。 515 LP などのロングパス フィルターは、515 nm よりも長い波長の光を通過させます (図 5)。
蛍光物質には特有の励起（吸収）曲線と発光曲線があり、励起ピークが理想的な励起波長（励起効率が高く、励起光エネルギーを低減し、細胞や色素を保護できる）、発光曲線が発光蛍光波長です。範囲。 したがって、実験では、励起のためにできるだけ励起ピークに近い波長を選択し、受信範囲には発光ピークを含める必要があります。 例えば、Alexa Fluor 488 の励起ピークは 500nm であり、蛍光顕微鏡では 480/40 の励起フィルターを選択できます。
フィルター キューブの詳細は、顕微鏡イメージング ソフトウェアで表示できます。 色素を理解し、サンプルに最適なフィルターを見つけることは、蛍光イメージングにとって重要です。 蛍光色素および蛍光タンパク質のスペクトル情報は、通常、説明書に記載されており、オンラインでも見つけることができます。
蛍光プローブの励起波長と発光波長に加えて、フィルター ブロックの選択では、非特異的励起があるかどうか、および多色標識サンプルのクロス カラーがあるかどうかも考慮する必要があります。 また、使用する蛍光灯光源についても考慮する必要があります。 現在、一般的に使用されている蛍光灯光源には、水銀灯、メタルハライドランプ、近年急速に発展しているLED光源があります。 蛍光光源のスペクトルは連続または不連続であり、エネルギーは異なる波長帯域で異なります。 LED光源は、その比較的狭いスペクトル帯域、より安定したエネルギー出力、長寿命、より安全で環境保護、および他の多くの利点により、徐々に蛍光顕微鏡の主要な光源になりつつあります。
顕微鏡の組み込みフィルター ブロックに加えて、外部高速ホイールもあります (図 7)。 ライカの外部高速ホイールに隣接するフィルターの変換速度は 27ms で、FRET や Fura2 レシオ カルシウム イメージングなどの高速マルチカラー実験を実現できます。 (図 8) ら。
多種多様な蛍光顕微鏡イメージング技術
さまざまな蛍光イメージングのニーズを満たすために、蛍光顕微鏡に加えて、さまざまな蛍光顕微鏡イメージング ソリューションが開発されています。
Leica THUNDER Imager などの広視野高解像度イメージング システムは、ライカの革新的なクリアリング技術を使用して、イメージング中に非焦点面干渉信号を効率的に除去し、鮮明な画像と高速イメージングの利点を提示します。
共焦点レーザー走査顕微鏡は、ピンホールを使用して非焦点面干渉を排除し、光学セクショニングを実現し、高精細画像と 3 次元画像を取得します。
回折限界を突破した超高解像度顕微鏡やナノ顕微鏡は、200nm以下の微細構造を観察することができます。
多光子励起の原理を利用した、厚い組織や生体内深部のイメージングを行う多光子イメージングシステム。
高い時間的および空間的解像度、高速イメージング速度、高解像度、低光毒性を備えたライトシートイメージング技術。発生に関する研究および生体内動的観察に特に適しています。
蛍光物質濃度、光退色、励起光強度などの影響を受けない蛍光寿命イメージング（FLIM）は、より詳細な機能的かつ正確な測定を行うことができます。
蛍光相関分光法 (FCS) および蛍光相互相関分光法 (FCCS) は、蛍光分子の分子数と拡散係数を測定し、それによって分子濃度、分子サイズ、粘度、分子運動、分子結合/解離、および分子光学特性を分析します。
全反射蛍光顕微鏡 (TIRF) は、非常に高い z 軸分解能を備えており、細胞膜表面の分子構造とダイナミクスの研究に最適です。
