光学顕微鏡の主な観察方法は蛍光観察です
蛍光とは、蛍光物質に特定の波長の光を照射すると、ほぼ同時に長波長の光を発する現象を指します（図1）。 特定の波長 (励起波長) の光が蛍光色素分子などの分子に当たると、光子エネルギーは分子の電子によって吸収されます。 次に、電子は基底状態 (S0) からより高いエネルギー準位である励起状態 (S1') に遷移します。 この過程を励起①といいます。 電子は 10-9–10-8 秒間励起状態に留まり、その間に電子はエネルギーを失います②。 電子が励起状態（S1）から基底状態③に戻る過程で、励起過程で吸収した残りのエネルギーが放出されます。
励起状態における蛍光分子の滞留時間は蛍光寿命であり、一般にナノ秒レベルであり、蛍光分子自体の固有の特性である。 蛍光寿命イメージング技術を用いた蛍光寿命イメージング（FLIM）は、蛍光寿命イメージング（FLIM）と呼ばれます。 蛍光強度イメージングに加えて、より詳細な機能的かつ正確な測定を取得して、分子の立体構造、分子間相互作用、および分子の微小環境を取得することができます。 従来の光学イメージングでは取得が困難な情報。
蛍光のもう 1 つの重要な特性は、励起ピークと発光ピークの間の波長の差であるストークス シフトです (図 2)。 通常、発光波長は励起波長よりも長くなります。 これは、蛍光物質が励起されてから光子を放出するまでに、電子が緩和過程でエネルギーの一部を失うためです。 ストークスシフトが大きい蛍光物質は、蛍光顕微鏡で観察しやすくなります。
蛍光顕微鏡および蛍光フィルターキューブ
蛍光顕微鏡は、蛍光の性質を利用して観察やイメージングを行う光学顕微鏡で、細胞生物学、神経生物学、植物学、微生物学、病理学、遺伝学などのさまざまな分野で広く使用されています。 蛍光イメージングは高感度と高特異性という利点があり、組織や細胞内の特定のタンパク質や細胞小器官の分布の観察、共局在と相互作用の研究、イオン濃度変化などの生命動態プロセスの追跡に非常に適しています。 、など。
細胞内のほとんどの分子は蛍光を発しないため、それらを確認するには蛍光標識する必要があります。 蛍光標識には、直接標識 (DAPI を使用して DNA を標識するなど)、抗体の抗原結合特性を利用した免疫染色、蛍光タンパク質 (GFP、緑色蛍光タンパク質など) を使用して標的タンパク質を標識するなど、多くの方法があります。 、リバーシブルバインディング。 合成染料（フラ-2など）など。
現在、蛍光顕微鏡はさまざまな研究室やイメージングプラットフォームの標準的なイメージング機器となっており、私たちの日常の実験に役立ちます。 蛍光顕微鏡は主に 3 つのカテゴリに分類されます: 正立蛍光顕微鏡 (スライスに適しています)、倒立蛍光顕微鏡 (スライスを考慮して生細胞に適しています)、蛍光実体顕微鏡 (植物、ゼブラフィッシュ (成体/胚など) などの大きな標本に適しています) ）、メダカ、マウス・ラットの臓器など）。
蛍光フィルター ブロックは、顕微鏡蛍光イメージングのコア コンポーネントです。 これは、励起フィルター、発光フィルター、ダイクロイック ビーム スプリッターの 3 つの部分で構成されます。 フィルターホイールに取り付けられています。 たとえば、Leica DMi8 には、6- ポジション フィルター ホイールが装備されています (図 3)。 異なる顕微鏡ホイールの位置の数は異なり、一部の顕微鏡ではフィルター ブロック スライドが使用されます。
フィルター ブロックは蛍光イメージングにおいて重要な役割を果たします。励起フィルターはサンプルを励起する励起光を選択し、他の波長の光をブロックします。 励起フィルターを通過した光はダイクロイックミラーを通過し（その機能は励起光を反射し、蛍光を透過することです）、反射後、対物レンズによって集光され、サンプルに照射され、対応する蛍光を励起します。 、発光した。 放射された光は対物レンズによって収集され、ダイクロイック ビーム スプリッターを通過して、放射フィルターに到達します。 図4に示すように、励起波長は450-490nm、ダイクロイックミラーは510nmより短い光を反射し、510nmより長い光を透過し、放射光の受信範囲は520-560nmです。
