微生物集団の決定 - 直接顕微鏡カウント法！
I. 目的要件
1、ヘマトクリットプレートカウントの原理を明らかにする。
2、ヘマトクリットプレートを用いた微生物計数法を習得する。
II. 基本原則
顕微鏡直接計数法は、検査するサンプルの少量の懸濁液を、面積と体積が定められた専用のスライド（細菌計数機とも呼ばれる）に載せ、顕微鏡で直接計数する簡単で迅速、直感的な方法です。現在、国内外でよく使われている細菌計数機は、血球計数プレート、Peteroff-Hauser細菌計数機、Hawksley細菌計数機などであり、酵母、細菌、カビ胞子などの懸濁液の計数に使用でき、基本的な原理は同じです。後者の2種類の計数機は、カバーガラスを装着した後の総容積が0.02mm3であり、カバーガラスとキャリアスライスの間の距離はわずか0.02mmであるため、油浸対物レンズを使用して細菌などのより小さな細胞を観察し、計数することができます。 これらのカウンターの使用に加えて、顕微鏡下で直接観察される塗抹面積と視野面積の比率を推定する方法もあり、これは一般に牛乳の細菌学的検査に使用されています。顕微鏡直接計数法の利点は、直感的で、迅速かつ操作が簡単であることです。ただし、この方法の欠点は、結果が通常、死んだ微生物と生きている微生物の合計になることです。この欠点を克服する方法はいくつかあり、たとえば、生きた細菌を染色したマイクロチャンバー培養（短時間）と細胞質分裂阻害剤の添加を組み合わせて、生きている微生物のみを計数するという目的を達成します。
操作手順
1、細菌懸濁液の調製
滅菌生理食塩水を使用して、適切な濃度のビール酵母の細菌懸濁液を作ります。
2、ミラー計数室
サンプルを追加する前に、まず計数プレートの計数室を検査する必要があります。汚れがある場合は、計数する前に清掃して乾燥させる必要があります。
3、サンプルの追加
カバーガラスで覆われた血球計数プレートを清潔で乾燥させ、滅菌毛細管ビュレットを使用してビール酵母懸濁液をカバーガラスの端から振って小さな滴を落とします。これにより、毛細管の浸透によって細菌液が隙間に沿って自動的に計数チャンバーに入り、通常、計数チャンバーは細菌液で満たされます。サンプルを採取するときは、まず細菌溶液をよく振る必要があります。サンプルを追加するときは、計数チャンバーに気泡があってはなりません。
4、顕微鏡によるカウント
サンプルを加えた後、5分間放置してから、血球計数プレートを顕微鏡のキャリアステージに置き、最初に低倍率で計数チャンバーの位置を見つけ、次に高倍率に変更して計数します。顕微鏡の光の強度を適切に調整します。反射光付きの顕微鏡の場合は、光が片側に偏らないように注意する必要があります。そうしないと、視野が計数チャンバーのグリッド線をはっきりと見ることができなかったり、垂直線しか見えなかったり、水平線しか見えなかったりします。計数前に細菌液が濃すぎたり薄すぎたりすることが判明した場合は、計数前に希釈を再調整する必要があります。一般的なサンプル希釈要件は、各細胞に約5〜10個の細菌が適切です。各計数チャンバーについて、5つの中央コンパートメント（4つの角と中央の1つの中央コンパートメント）の微生物が計数用に選択されます。グリッド線上にある微生物は、通常、上と右の線でのみ計数されます。 酵母の出芽の場合、出芽体が母細胞の半分の大きさに達すると、2つの微生物としてカウントされます。2つの計数室からのサンプルを平均値でカウントし、サンプルの細菌含有量を計算します。
5. ヘマトクリットプレートの洗浄
使用後は、血球計数プレートを水道水で洗い流してください。洗浄やブラッシングには硬いものを使用しないでください。自分で乾かすか、洗った後にヘアドライヤーで乾かしてください。プレートを顕微鏡で検査し、各コンパートメントに残留微生物やその他の沈殿物がないかどうかを確認します。きれいでない場合は、きれいになるまで洗浄を繰り返す必要があります。
