蛍光顕微鏡と通常の顕微鏡の違い
最近、マウスの凍結切片をいくつか作成してみました。次に、蛍光顕微鏡を使用して、注入したウイルスが目的の脳領域にあるかどうかを確認します。蛍光顕微鏡の基本原理を簡単に学習する必要があるので、ここで共有します。
蛍光顕微鏡は、紫外線を光源として検査対象物を照らし、対象物を発光させ、顕微鏡下で対象物を観察します。主に免疫蛍光細胞に使用されます。主に光源、フィルタープレートシステム、光学系で構成されています。接眼レンズと対物レンズの拡大を通してサンプルの蛍光像を観察します。蛍光顕微鏡と通常の光学顕微鏡の違いを見てみましょう。
1. 照明方法を見る
蛍光顕微鏡の照明方法は一般的に落射照明であり、これは光源が対物レンズを通して試験サンプル上に置かれることを意味します。
2. 解像度を確認する
蛍光顕微鏡は、通常の光学顕微鏡よりも波長が短いですが解像度が高い紫外線を光源として使用します。
3. フィルターの違い
蛍光顕微鏡では、光源の前に設置して可視光を遮断するフィルターと、対物レンズと接眼レンズの間に設置して紫外線を遮断するフィルターの 2 つの特殊なフィルターが使用され、人間の目を保護します。
蛍光顕微鏡も光学顕微鏡の一種です。主な理由は、蛍光顕微鏡で励起される波長が短いため、蛍光顕微鏡と通常の顕微鏡の構造と用途に違いが生じることです。ほとんどの蛍光顕微鏡は、弱い光を捉える機能が優れています。そのため、非常に弱い蛍光でも画像化能力が優れています。近年の蛍光顕微鏡の継続的な改良と相まって、ノイズも大幅に減少しました。そのため、ますます多くの蛍光顕微鏡が使用されています。
二光子蛍光顕微鏡に関する知識
2光子励起の基本原理は、高光子密度の条件下で、蛍光分子が2つの長波長光子を同時に吸収し、いわゆる励起状態寿命の短い後に、より短い波長の光子を放出することです。;その効果は、長波長の半分の波長の光子を使用して蛍光分子を励起するのと同じです。 2光子励起には高い光子密度が必要です。細胞にダメージを与えないように、2光子顕微鏡では高エネルギーモードロックパルスレーザーを使用しています。このレーザーは、ピークエネルギーが高く平均エネルギーが低いレーザー光を放出し、パルス幅はわずか100フェムト秒、周波数は80〜100MHzです。高開口数対物レンズを使用してパルスレーザーの光子を焦点に合わせると、対物レンズの焦点での光子密度が最も高くなります。 2光子励起は対物レンズの焦点でのみ発生するため、2光子顕微鏡では共焦点ピンホールが不要になり、蛍光検出効率が向上します。
一般的な蛍光現象では、励起光の光子密度が低いため、蛍光分子は同時に 1 つの光子しか吸収できず、その後、放射遷移によって 1 つの蛍光光子を放出します。これが単光子蛍光です。レーザーを光源として使用する蛍光励起プロセスでは、2 光子または多光子蛍光現象が発生する可能性があります。この場合、使用する励起光源の強度が高く、光子密度は蛍光分子が同時に 2 つの光子を吸収するための要件を満たしています。通常のレーザーを励起光源として使用するプロセスでは、光子密度はまだ 2 光子吸収を生成するのに十分ではありません。通常、フェムト秒パルスレーザーが使用され、その瞬間電力はメガワットレベルに達することがあります。したがって、2 光子蛍光の波長は励起光の波長よりも短くなり、これは半励起波長励起によって生成される効果に相当します。
