2光子蛍光顕微鏡には多くの利点がある
1) 長波長の光は短波長の光よりも散乱の影響を受けにくく、試料に容易に浸透します。
2) 焦点面の外側にある蛍光分子は励起されないため、より多くの励起光が焦点面に到達し、励起光が試料のより深いところまで浸透します。
3) 長波長の近赤外線は短波長の光よりも細胞に対する毒性が低い。
4) 2光子顕微鏡で標本を観察する場合、光退色と光毒性は焦点面でのみ発生します。そのため、厚い標本の観察、生きた細胞の観察、または定点光退色実験を行うには、1光子顕微鏡よりも2光子顕微鏡の方が適しています。
共焦点蛍光顕微鏡に関する知識
共焦点蛍光顕微鏡の基本原理：点光源を使用して標本を照らし、焦点面に小さく明確な光点を形成します。照明された後にスポットから放出された蛍光は、対物レンズによって収集され、元の照明光路に沿ってダイクロイックミラーに戻ります。ビームスプリッターを構成します。分光計は蛍光を直接検出器に送ります。光源と検出器の前にピンホールがあり、それぞれ照明ピンホールと検出ピンホールと呼ばれます。2つの幾何学的寸法は一貫しており、約100-200nmです。焦点面上の光点に対して、2つは共役です。つまり、光点は一連のレンズを通過し、最終的に照明ピンホールと検出ピンホールに同時に焦点を合わせることができます。このようにして、焦点面からの光は検出穴内に集中できますが、焦点面の上または下からの散乱光は検出穴の外側で遮断され、画像化できません。 サンプルはレーザーで点ごとにスキャンされ、検出ピンホールの後ろにある光電子増倍管も対応する光点の共焦点画像を点ごとに取得し、デジタル信号に変換されてコンピュータに送信され、最終的に画面上で焦点面全体の鮮明な共焦点画像に集約されます。
各焦点面画像は、実際には試料の光学断面です。この光学断面には常に一定の厚さがあり、光学薄片とも呼ばれます。焦点での光強度は非焦点での光強度よりもはるかに大きく、非焦点面の光はピンホールによってフィルタリングされるため、共焦点システムの被写界深度はほぼゼロです。 Z軸方向に沿ってスキャンすると、光トモグラフィーが実現され、サンプルの焦点スポットで目的の2次元光学断面を観察できます。 XY平面（焦点面）スキャンとZ軸（光軸）スキャンを組み合わせて、連続したレベルの2次元画像を蓄積し、専用のコンピューターソフトウェアで処理することで、サンプルの3次元画像を取得できます。
つまり、検出ピンホールと光源ピンホールは常に同じ点に焦点が合うため、焦点面の外側で励起された蛍光は検出ピンホールに入ることができません。
レーザー共焦点顕微鏡の動作原理を簡単に説明すると、レーザーを光源として使用することです。従来の蛍光顕微鏡画像に基づいて、レーザー走査装置と共役焦点装置が追加され、システムはコンピューターによって制御され、デジタル画像を収集および処理します。
