二光子蛍光顕微鏡に関する知識-
2 光子励起の基本原理は、光子密度が高い場合、蛍光分子が 2 つの長波長光子を同時に吸収し、いわゆる励起状態寿命と呼ばれる短期間の後により短い波長の光子を放出できることです。-この効果は、長波長の半分の波長を持つ光子を使用して蛍光分子を励起するのと同じです。 2 光子励起には高い光子密度が必要です。細胞の損傷を避けるために、2 光子顕微鏡では高-エネルギー モード-ロック パルス レーザーが使用されます。-このレーザーから放射されるレーザーは、ピーク エネルギーが高く、平均エネルギーが低く、パルス幅はわずか 100 フェムト秒、周波数は最大 80 ～ 100 メガヘルツです。高開口数の対物レンズを使用してパルスレーザーの光子を集束させる場合、対物レンズの焦点における光子密度が最も高く、二光子励起は対物レンズの焦点でのみ発生します。-したがって、二光子顕微鏡では共焦点ピンホールが不要となり、蛍光検出の効率が向上します。
一般的な蛍光現象では、励起光の光子密度が低いため、蛍光分子は一度に 1 つの光子しか吸収できず、放射遷移によって別の蛍光光子を放出します。これは単一光子蛍光として知られています。光源としてレーザーを使用する蛍光励起プロセスでは、2 光子または多光子蛍光現象が発生する可能性があります。-この場合、使用される励起光源は、蛍光分子が 2 つの光子を同時に吸収するという要件を満たす高い強度と光子密度を備えています。一般的なレーザーを励起光源として使用するプロセスでは、二光子吸収現象を引き起こすには光子密度がまだ不十分です。通常、フェムト秒パルス レーザーが使用され、瞬間出力はメガワット レベルに達します。したがって、2光子蛍光の波長は励起光の波長より短く、励起波長の半分の励起によって生じる効果と同等です。
