多光子顕微鏡の焦点深度を拡大する方法
2 光子レーザー走査型顕微鏡とカルシウム指示薬の組み合わせは、生体内神経信号検出のゴールドスタンダードです。-ニューラル ネットワーク内のニューロンは 3 次元空間に分散されており、その活動ダイナミクスをモニタリングするには、ボリューム イメージング率を迅速に向上させる方法が必要です。-ただし、回折格子走査型多光子顕微鏡を使用して多数の画像を撮像する場合、高い横方向解像度を達成するために高い開口数 (NA) 対物レンズを使用すると、焦点深度が小さくなります。浅い焦点深度でボリュームイメージングを取得するには、
何らかの手段で Z- 軸スキャンを実行し、各焦点面をスキャンして多くの面をイメージングする必要があるため、イメージング速度が大幅に制限されます。軸方向の画像情報を犠牲にし、焦点深度を拡張することで 1 回の側方走査でボリューム スキャンを達成できれば、つまりボリューム情報を 1 枚の 2D 画像に投影できれば、イメージング速度を大幅に向上できます。これは拡張焦点深度 (EDF) イメージングと呼ばれ、神経活動の機能イメージングなど、高い時間分解能を必要とする疎な集団構造のイメージングに特に役立ちます。
顕微鏡の軸方向および横方向の解像度は、対物レンズの開口数 (NA) によって決まります。 NA が高いと、軸方向および横方向の解像度と収集される光の量を最大化できます。 NAが低いと、軸方向の解像度が低くなり、つまり焦点深度が長くなりますが、同時に横方向の解像度と集光効率が犠牲になります。次に紹介する焦点深度を拡大する方法では、高い横解像度と十分な光束を維持しながらこれを達成できます。
空間光変調器を使用して焦点の細いベッセルビームを生成すると、EDF イメージングを実現できますが、空間光変調器はかさばるため、狭い顕微鏡スペースに適合させるのが困難です。対照的に、アキシャルピラミッドに基づくベッセルモジュールは安価でコンパクトですが、固定深度の焦点しか生成できず、焦点深度を連続的に変更する必要があるさまざまな実験には適していません。この問題に対処するために、2018 年に RONGWEN LU らは、は、アキシコンに基づくベッセルモジュールを実証しました。このモジュールでは、ベッセル焦点の軸長を連続的に調整するために、1 つのレンズだけを光軸に沿って移動させる必要があります。
図 1 (a) ベッセルモジュールのデバイス図。 （ b ）点広がり関数は、Dがそれぞれ-12mm、0mm、12mmの場合に実験的に測定されました。 (c) 横方向半値全幅、(d) 軸方向半値全幅、(e) ピーク信号、(f) L2 変位 D の対物レンズ後方の光パワーの関係
可変長ベッセル焦点を形成するためのモジュールデバイスを図 1a に示します。入射ガウスビームは、アキシコンとレンズL1を通過した後、円形ビームに整形されます。後続の円形開口マスクは、アキシコン欠陥によって引き起こされる迷光をブロックすることができ、それによって 2 光子励起点広がり関数の軸方向の分布を形成します。その後、光ビームはレンズ L2、L3 によってガルバノメータに投影され、レンズ L4、L5 を通って対物レンズの後側焦点面に到達します。
これらの設計は従来のピラミッドベースのモジュールに似ていますが、光軸に沿って L2 または L3 を移動させることでベッセル焦点の軸長を連続的に調整できる点が異なります。図 1b は、-12mm、0mm、12mm の D 値に対する軸方向の点広がり関数を示しています。軸方向の半値全幅は 39?です。 24歳？ Mと14？メートル。図1c〜fに示すように、レンズL2を左から右に動かすと、横方向と軸方向の両方で半値全幅が連続的に変化します。つまり、焦点深度が連続的に変化します。ベクトル回折理論に基づく数値シミュレーション結果は実験データとよく一致しています。図 2 は、アキシコン欠陥に対するさまざまなサイズの環状マスクの補正効果を検証しています。より薄い環状マスクは、出力ベッセルビームの軸方向強度分布をより適切に最適化できるが、同時に、より多くの電力損失にもつながることが判明した。
