顕微鏡イメージング教室丨蛍光顕微鏡の応用
全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) は、2 つの異なる屈折率媒体間を伝播する光線によって生成されるエバネッセント波を利用して、蛍光標識された生細胞の表面をプローブする技術です。 実際には、入射レーザービームがカバースリップと細胞を含む水性媒体の間の界面に当たると、臨界角で反射されます（全反射）。 エバネッセント波のエネルギーはカバースリップからの距離とともに指数関数的に減少するため、表面から 10 ナノメートル以内 (10 ～ 200 ナノメートル) の蛍光団のみがエバネッセント波によって励起され、それより離れた蛍光団はほとんど励起されません。 影響を受ける。 したがって、TIRFM では、カバースリップの近くにある蛍光色素からの高い信号レベルが非常に暗い背景に重ねられ、優れた信号対雑音比が得られます。 励起深さの極端な制限は、カバーガラス表面近くの接着細胞の単一分子または膜および細胞小器官の組成を研究するのに理想的です (図 8(e) を参照)。 励起はカバーガラス付近の薄い領域に限定されるため、光退色や光毒性もこれらの領域に限定され、TIRFM は長期観察に最も有用な方法の 1 つとなります。 この技術は、細胞生物学および分子生物学の幅広い現象を研究するための基本的なツールとなっています。
デコンボリューションは、特定の画像面または複数の焦点面の画像スタック内の光子信号を強化するために、光 (Z) 軸に沿って取得された一連の全焦点画像に適用されるアルゴリズムです。 顕微鏡には、サンプルの焦点面間で正確に定義された間隔で画像を取得できるように、高精度の電動フォーカス ドライブが装備されている必要があります。 典型的なアプリケーション（図 8(f) を参照）では、デコンボリューション プロセスを使用して、広視野蛍光励起と発光を使用して所定の焦点面から焦点が合っていない光をぼかし、除去します。 最も複雑なアプリケーションは、画像スタック全体にデコンボリューション プロセスを適用して、投影ビューまたは 3D モデルを生成することです。 デコンボリューションに使用される一連の広視野画像は、サンプルから放出される理論上の最大数のフォトンを捕捉します。 デコンボリューション プロセスにより、焦点面の上下で放出された光子の「ぼやけた」強度が元の面に再配分されます。 したがって、デコンボリューションでは、ほぼすべての利用可能な発光強度が使用され、最適な光バジェットが提供されるため、この技術は非常に光に敏感なサンプルに最適な方法となります。
蛍光顕微鏡における共鳴エネルギー移動現象の一種である蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、生細胞内のタンパク質、脂質、酵素、核酸の結合と相互作用に関する定量的な時間的および空間的情報を取得するために使用されます。 FRETは定常状態技術または時間分解技術のいずれかを使用できますが、時間分解FRETイメージングにはドナーとアクセプターの距離をより正確にマッピングできるという利点があります。 FRET イメージングには、適切な励起および発光フィルターと高感度カメラを備えた標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用できます。 環境に敏感なタンパク質またはペプチドを 2 つの FRET に適用可能な蛍光タンパク質の間に挟んだバイオセンサーは、現在細胞生物学で広く使用されています。 これらのプローブは、増感発光 FRET 技術とレシオメトリック分析を組み合わせた広視野蛍光顕微鏡下で容易に画像化できます。 さらに、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用したスペクトルイメージングと線形分解は、バイオセンサーやその他の蛍光タンパク質アプリケーションにおける FRET 現象のモニタリングに役立ちます。
蛍光寿命イメージング顕微鏡法 (FLIM) は、蛍光寿命と画像内のすべての位置での蛍光色素分子の空間的位置を同時に記録できる高度な技術です。 このメソッドは、単一生細胞における pH、イオン濃度、溶媒極性、非共有結合相互作用、粘度、酸素分圧などの環境パラメーターを研究するメカニズムを提供し、データを空間的および時間的配列で表示します。 ナノ秒スケールでの励起状態寿命の FLIM 測定は、局所的な蛍光色素分子濃度、光退色効果、経路長 (サンプルの厚さ) には依存しませんが、共鳴エネルギー移動などの励起状態反応には敏感です。 実際、共鳴エネルギー移動の前後の蛍光ドナーの寿命変化を監視することによって FLIM と FRET を組み合わせることが、この現象を研究する最良の方法の 1 つであると考えられています。
蛍光標識された高分子および小さな蛍光体の移動度 (横拡散係数) は、光退色後の蛍光回復 (FRAP) 技術によって決定できます。 FRAP では、非常に小さな選択領域 (直径数マイクロメートル) が通常レーザーで強く照射され、その領域の蛍光色素分子が完全に光退色します。 その結果、蛍光が劇的に減少または消滅します。 光退色パルス後、退色領域の蛍光強度回復の速度と程度を低い励起強度で時間の関数として監視し、蛍光団の再増殖と回復の動態に関する情報を生成しました (図 9)。 FRAP は通常、EGFP またはその他の蛍光タンパク質を使用して実行されます。 関連する光活性化技術は、UV または紫の短いパルスによって活性化できる特殊な合成ケージ型蛍光色素または同様の機能を有する蛍光タンパク質に基づいています。 光活性化と FRAP は、移動度パラメーターを決定するための補完的な技術として使用できます。
光退色後の蛍光損失（FLIP）と呼ばれる FRAP に関連する技術では、生細胞内の規定の蛍光領域が強い照射によって繰り返し光退色を受けます。 測定期間中にすべての蛍光色素が光退色されている領域に拡散できた場合、細胞全体で蛍光シグナルが完全に失われることになります。 細胞全体から蛍光が消える速度を計算することにより、標的蛍光団の拡散移動度を決定できます。 さらに、FLIP は、ニューロンの体細胞と軸索の間の障壁など、細胞の個々のコンパートメント間の拡散障壁の位置と性質を容易に識別できます。
蛍光相関分光法 (FCS) は、主にレーザー走査型共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡で使用され、化学反応速度、拡散係数、分子量、流速、凝集などの速度論的情報を決定するために設計された方法です。 FCS では、小さな体積 (約 1 フェムトメートル、レーザーの回折限界焦点) に集束レーザー ビームを照射し、蛍光分子のダイナミクスによって誘発される自家蛍光の強度変動を、蛍光分子が占める体積内の時間の関数として記録します。分子（図10）。 比較的小さな発蛍光団は、照射された空間内で急速に拡散し、ランダムな強度の短いバーストを生成します。 逆に、より大きな複合体（高分子に結合した蛍光団）はよりゆっくりと移動し、より長く持続的な時間依存性の蛍光強度パターンを生成します。
蛍光標識された構造が生細胞の特定領域に密集して重なっている場合、その動態や空間分布を解析するのは困難です。 蛍光スポット顕微鏡 (FSM) は、ほとんどすべてのイメージングモダリティと互換性のある技術で、非常に低濃度の蛍光標識サブユニットを利用し、焦点の合っていない蛍光を低減し、厚い領域での標識構造とそのダイナミクスの可視性を向上させます。 FSM は、対象となる構造全体の一部のみにラベルを付けることによって実装されます。 この意味で、FSM は視野全体にわたって FCS を実行するのと似ていますが、定量的な時間分析よりも空間パターンに重点が置かれています。 蛍光スポット顕微鏡は、活動亢進細胞におけるアクチンや微小管などの細胞骨格要素の移動性と凝集を測定するのに特に役立ちます。
誘導放出枯渇顕微鏡 (STED) は、回折限界をはるかに超える空間分解能を備えた新興の超解像技術であり、リング状の枯渇光を使用してより小さい励起光ビームを囲み、軸上でサブ-50 nmを取得します。解像度。 この技術は、同期レーザーパルスと空間的に調整された円形STEDパルスによる蛍光色素の励起に依存しており、放出された光を枯渇させ、レーザー走査焦点の周囲で励起された分子の蛍光を抑制します。 スポットの周辺で発生する蛍光は抑制されますが、スポットの中心では抑制されないため、蛍光スポットのサイズが大幅に減少し、それに応じて解像度が大幅に向上します。 STED は、生細胞の高解像度検出に有用なツールであることが証明されています。 光活性化局在化顕微鏡法 (PALM) や構造化光照明顕微鏡法 (SIM) などの他の新しい超解像技術も、近い将来、生細胞イメージングの基本的なツールとなるでしょう。
生細胞イメージングのための遺伝的にコードされた蛍光タンパク質と高度な合成蛍光色素の使用が増えていることで、時間的ダイナミクスと空間的関係をモニタリングするための新しい光学モダリティへの扉が開かれています。 顕微鏡医は現在、さまざまな時間スケールにわたって複数の解像度で発生する細胞プロセスの画像データを観察および記録するための完全なツールセットを持っています。 より遅いイベントはレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して簡単に観察および記録できますが、より速い速度イベントはスピニングディスク技術を使用して取得できます。 さらに、多光子顕微鏡により厚い組織の深部イメージングが可能になり、全反射技術により共焦点精度で膜表面を調べることが可能になります。 FRET、FLIM、FRAP、FCS、FSM、SIM、PALM、STED などの高度な蛍光法を使用すると、多くの場合回折限界よりも優れた解像度でタンパク質間相互作用をモニタリングできます。 蛍光色素、顕微鏡、検出器技術の進歩により、より広い世界が「顕微鏡の下」に持ち込まれることになります。
