蛍光顕微鏡の原理

蛍光顕微鏡の原理

蛍光顕微鏡は通常の光学顕微鏡とは異なります。 通常の光源を照射して標本を観察するのではなく、顕微鏡下で特定の波長の光（通常は紫外光、青紫光）を用いて標本中の蛍光物質を励起し、蛍光を発させます。 したがって、蛍光顕微鏡の光源は直接照明として機能するのではなく、標本内の蛍光物質を励起するエネルギー源として機能します。 私たちが標本を観察できるのは光源の照射によるものですが、標本中の蛍光物質が励起光のエネルギーを吸収した後に現れる蛍光現象です。

蛍光顕微鏡の特徴は、光源が特定の波長域の励起光を多量に供給できるため、試料中の蛍光物質が必要な強度の励起光を得ることができることがわかります。 同時に、蛍光顕微鏡には対応するフィルターシステムが必要です。

蛍光顕微鏡検査は、免疫蛍光組織化学において不可欠なツールです。 超高圧光源、フィルター系（励起フィルター、抑制フィルター板を含む）、光学系、撮影系などの主要部品で構成されています。 特定の波長の光を使用して標本を励起し、蛍光を発します。

蛍光の励起方法：光の波長範囲により、UV励起法（紫外線照明法を使用）とBV励起法（青紫光を使用）の2種類に分けられます。 UV励起法は400nmより短い近紫外光を励起に使用します。 この方法では可視の励起光が存在しないため、観察される蛍光は色素固有の蛍光を示し、標本上の特定の蛍光と背景組織の自己蛍光を簡単に区別できます。

BV 励起法は、紫外光から青色光までの励起には 404nm および 434nm に基づいています。 この方法では青色光を標本に照射するため、蛍光観察システムのカットフィルターには青色光を完全に遮断し、必要な緑色と黄色の蛍光を完全に透過するフィルターを使用する必要があります。 蛍光抗体アッセイ用の蛍光色素。 励起光の最大吸収波長は蛍光の最大発光波長に比較的近いため、BV励起法で使用するフィルターにはシャープなカットオフフィルターを使用する必要があります。 この方法では励起光として青色光を利用できるため、蛍光色素の吸収効率が高く、より明るい画像が得られます。 欠点は、500nm以下の蛍光が見えず、500nm以上の蛍光があると画像全体が黄色く見えることです。 蛍光抗体法では、蛍光色素の特異性を蛍光色素特有の色で判断することが多い。 したがって、微妙な特異性を議論する場合、BV 励起法の上記の欠点が大きな影響を与えることがよくあります。

以上をまとめると、蛍光顕微鏡の照明は、コンデンサーの構造と励起光の波長に応じて、次の3点で考えることができます。

① 蛍光画像のコントラスト要求の観点から、照明には UV 励起暗視野集光器を使用します。

② 画像の明るさを考慮すると、BV 励起フィルターが最も暗視野観察効率が高くなります。

③UV励起フィルター暗視野観察とBV励起暗視野コンセントレーター照明の特性は、この2つの照明法の中間と考えることができますが、前者の方が暗視野特性が強く、より明るい画像を表示します。 コントラストは小さいです。 後者は暗視野光路の特性を保持しているため、表示される画像はより暗くなり、コントラストが向上します。 実際に蛍光顕微鏡を使用する場合には、標本に応じた照明方法で観察する必要があります。

たとえ最良のコントラストを備えた紫外励起暗視野コンデンサーが照明されたとしても、試料によって屈折または散乱された紫外励起光の一部が対物レンズに入射することを指摘しなければなりません。 自家蛍光は画像応答を悪化させる可能性があります。 したがって、接眼レンズの前にカットオフフィルターとして紫外線吸収フィルターを使用する必要があります。