超解像顕微鏡のさまざまな技術の比較
従来の光学顕微鏡では、光の回折により画像解像度が約 250 nm に制限されます。 現在、超解像技術によりこれを 10 倍以上改善できます。この技術は主に 3 つの方法によって実現されます。1 つは感光性局在顕微鏡法 (PALM) や確率的光学再構成顕微鏡法 (STORM) を含む単一分子局在顕微鏡法です。 構造化照明顕微鏡 (SIM); 誘導放出破壊顕微鏡法（STED）。 超解像技術をどう選ぶかは誰もが気になるところです。 「残念ながら、どの方法を使用するかを決定するための単純な原則はありません」と、英国オックスフォード大学の博士研究員マシュー・ストラシー氏は言います。 「それぞれに長所と短所があります。」 もちろん科学者たちは、特定のプロジェクトに適切な方法を選択する方法も考え出しています。 「バイオイメージングの文脈では、考慮すべき重要な要素には、空間的および時間的解像度、光損傷に対する感度、標識能力、サンプルの厚さ、バックグラウンド蛍光または細胞自己蛍光が含まれます。」 仕組み さまざまな超解像顕微鏡は、さまざまな方法で動作します。 PALM および STORM の場合、特定の瞬間に蛍光マーカーのごく一部のみが励起または光活性化されるため、高精度での独立した位置特定が可能になります。 すべての蛍光ラベルでこのプロセスを実行すると、完全な超解像度画像が得られます。 2014年のノーベル化学賞受賞者の一人でマックス・プランク生物物理化学研究所所長のステファン・ヘル氏は、「PALM/STORMシステムはセットアップが比較的簡単だが、応用するのは難しい。限界点は、細胞内で単一の蛍光分子を検出する必要があり、STED よりも信頼性が低いことです。」 STED は、レーザー パルスを使用して蛍光団を励起し、リング状レーザーを使用して蛍光団を消光し、超解像のために中間のナノメートル サイズの蛍光のみを残します。 サンプル全体をスキャンすると画像が生成されます。 「STED の利点は、ボタンを押すだけのテクノロジーであることです」とヘル氏は説明しました。 「標準的な共焦点蛍光顕微鏡と同じように機能します。」 また、緑色または黄色の蛍光タンパク質やローダミン由来の色素などの蛍光色素を使用して生きた細胞を画像化することもできます。 パラメトリック比較 すべての超解像技術は解像度の点で従来の光学顕微鏡を上回っていますが、それらは互いに異なります。 SIM では解像度が約 2 倍の約 100 nm になります。 PALM と STORM は 15 nm のターゲットを分解できます。 Hell 氏によると、STED は生細胞では 30 nm、固定細胞では 15 nm の空間分解能を提供します。 特定のアプリケーションに関しては、信号対雑音比も考慮する必要があります。 場合によっては、解像度は低くても SNR が高い方が、その逆 (解像度は高いが SNR が低い) よりも優れた画像が得られることがあります。 画像取得の速度も、特に生細胞の場合には非常に重要です。 「すべての超解像技術は、従来の蛍光イメージング技術よりも低速です」と Stracy 氏は述べています。 「PALM/STORM は最も遅く、単一の画像を取得するのに数万のフレームが必要です。SIM は数十のフレームを必要とします。STED はスキャン技術であるため、取得速度は視野のサイズに依存します。」 生きた細胞や固定されたイメージング細胞に加えて、物体がどのように動くかを理解したいと考える科学者もいます。 ストラシーは、単なる静止画像ではなく、生きた細胞における生物学的システムのダイナミクスを理解することに興味を持っています。 彼は PALM と単一粒子追跡を組み合わせて、生きた細胞のダイナミクスを分析します。 このようにして、マーカー分子がその機能を実行するときに、マーカー分子を直接追跡することができます。 しかし、SIM はこれらの動的なプロセスを分子レベルで研究するのには適していないが、取得速度が速いため、染色体全体などのより大きな構造の動態を観察するのには特に適していると同氏は考えています。 最新の結果 2017 年、Hell のチームは MINFLUX 超解像度顕微鏡を Science 誌に報告しました。 Hell氏によると、この超解像手法により初めて1nmの空間分解能を達成したという。 さらに、他の方法よりも少なくとも 100 倍の速さで生細胞内の個々の分子を追跡できます。 他の科学者も MINFLUX 顕微鏡を高く評価しました。 「新しいアプリケーションやアプローチは常に開発されていますが、私にとっては 2 つの進歩が際立っています」とシェクトマン氏は言います。 1つはMINFLUXです。 「独創的なアプローチを使用して、非常に正確な分子の位置を取得します。」 2 番目のエキサイティングな展開について、シェクトマン氏は WE メルナー氏とスタンフォード大学の同僚について言及しました。 メルナー氏は2014年のノーベル化学賞の受賞者でもある。 優勝者の一人。 蛍光単一分子の異方性散乱によって引き起こされるイメージング解像度の制限に対処するために、科学者たちは異なる励起偏光を使用して分子の配向と位置を決定しました。 さらに、彼らは繊細な瞳孔表面を発達させました。 これらの技術により、構造の位置を特定する能力が向上します。 蛍光ラベルについて 多くの超解像度アプリケーションでは、ラベルが非常に重要です。 関連商品を提供している会社もあります。 たとえば、ドイツの Miltenyi は、Stefan Hell が設立した会社である Abberior と提携して、超解像顕微鏡色素用のカスタム抗体結合サービスを提供しています。 他の多くの企業も適合するマーカーを提供しています。 「当社のナノブースターは非常に小さく、わずか 1.5 kDa であり、特異性が非常に高いです」と ChromoTek のマーケティング責任者、Christoph Eckert 氏は述べています。 これらのタンパク質は、緑色および赤色の蛍光タンパク質 (GFP および RFP) に結合します。 これらは、VHH またはナノボディとして知られるアルパカ抗体フラグメントに由来し、優れた結合特性とバッチ間の変動のない安定した品質を備えています。 これらのマーカーは、SIM、PALM、STORM、STED などのさまざまな超解像技術に適しています。 メリーランド大学医学部助教授の Ai-Hui Tang 氏らは、ChromoTek の GFP ブースターと STORM を使用して、神経系における情報伝播を調査しました。 彼らは、シナプス前およびシナプス後ニューロンで、ナノカラムと呼ばれる分子ナノクラスターを発見しました。 科学者らは、この構造は中枢神経系がシナプス効率を維持し調節するために単純な原理を採用していることを示していると考えている。 超解像度イメージングのさまざまなバージョンとその方法の増加により、科学者は生物学の謎にさらに深く迫っています。 可視光の回折限界を突破することで、生物学者は細胞の活動を「厳密に監視」することさえ可能になります。
