蛍光顕微鏡の紹介
蛍光顕微鏡とは、フルオレセインで染色した対象物に短波長の光を照射し、励起して長波長の蛍光を発生させて観察するものです。 蛍光顕微鏡では、試料の照明光から特定の波長の励起光を選択して蛍光を発生させ、励起光と蛍光の混合光から蛍光を分離して観察する必要があります。 したがって、フィルターシステムは特定の波長を選択する上で非常に重要な役割を果たします。 蛍光顕微鏡は、生物学、医学、その他の分野で広く使用されています。
1. 蛍光顕微鏡の主なコンポーネント:
(A) 光源： 光源はさまざまな波長（紫外線から赤外線まで）の光を放射します。 の
(B) 励起フィルター光源: 蛍光の励起に役に立たない光を遮断しながら、標本に蛍光を発生させる可能性がある特定の波長の光を通過させます。 の
(C) 蛍光標本: 通常は蛍光色素で染色されます。 の
(D) 遮断フィルター: 標本に吸収されない励起光を遮断し、蛍光を選択的に透過させます。蛍光の中の一部の波長が選択的に透過されます。
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2. 蛍光顕微鏡の分類:
蛍光顕微鏡は一般に、透過型と落射型の 2 つのタイプに分類されます。
ａ． 透過型：励起光は検査対象物の底面から入射し、集光器は暗視野集光器であるため、励起光は対物レンズに入射せず、蛍光は対物レンズに入射します。 低倍率では明るいですが、高倍率では暗くなります。 油浸や芯出しでは作業が困難です。 低倍率で照明範囲を決定することは特に困難ですが、背景の視野が非常に暗くなってしまう可能性があります。 透過型は不透明なオブジェクトには使用されません。 の
b. エピ型：透過型は現在ほぼ廃止されています。 新しい蛍光顕微鏡のほとんどはエピ型です。 光源は検査対象物の上方から照射され、光路中にビームスプリッターが入っているため、透明・不透明な検査対象の両方に適しています。 対物レンズが集光レンズの役割を果たすため、操作が容易なだけでなく、低倍率から高倍率まで視野全体を均一に照明できます。 の
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3. 透視検査時の注意事項
ａ． 励起光を長時間照射すると蛍光の減衰や消光が起こるため、観察時間をできるだけ短くし、一時的に観察しないときはバッフルなどで励起光を覆うようにしてください。 の
b. 油浸レンズで観察する場合は「無蛍光油」を使用してください。 の
c. 蛍光はほとんどの場合弱いため、暗い部屋で行う必要があります。 の
d. 電源に電圧安定器を取り付けるのが最善です。そうしないと、電圧が不安定になり、水銀ランプの寿命が短くなるだけでなく、顕微鏡検査の効果にも影響します。 の
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4. 蛍光顕微鏡の使用
1. 蛍光顕微鏡標本の準備要件
ａ． スライドガラス
スライド ガラスの厚さは 0.8 ～ 1.2 mm である必要があります。 スライドが厚すぎると、一方でより多くの光が吸収され、他方では、励起光を標本に集中させることができなくなります。 スライドは滑らかで、厚さが均一で、明らかな自家蛍光があってはなりません。 石英ガラスのスライドが使用されることもあります。 の
b. カバーガラス
カバーガラスの厚さは約0.17mmで、滑らかです。 励起光を強化するために、乾燥したカバー ガラスを使用することもできます。これは、異なる波長の光に対して異なる干渉効果を持つ物質 (フッ化マグネシウムなど) の複数の層でコーティングされた特殊なカバー ガラスです。蛍光もスムーズに進みます。 励起光が透過し、反射した励起光が試料を励起します。 の
c. 検体
組織切片やその他の標本は厚すぎてはいけません。 厚すぎると励起光の大部分が試料下部で消費され、対物レンズで直接観察される上部を十分に励起できなくなります。 また、細胞の重なりや不純物の隠蔽も判定に影響を与えます。 の
d. 封入剤
グリセリンは封入剤として一般的に使用されますが、自家蛍光がなく、無色透明である必要があり、蛍光の明るさは pH 8.5-9.5 でより明るく、すぐに色あせしにくいです。 したがって、グリセロールとpH 9.0〜9.5の0.5mol/L炭酸緩衝液の等量混合物がマウント剤として一般的に使用されます。 の
e. ミラーオイル
一般に、暗視野蛍光顕微鏡や油浸対物レンズで標本を観察する場合には、液浸油を使用する必要があります。 ミラーオイルは無蛍光の専用オイルを使用するのがベストで、上記グリセリンの代わりに流動パラフィンも使用できますが、屈折率が低いため画質に若干の影響を与えます。
