共焦点蛍光顕微鏡に関する知識
共焦点蛍光顕微鏡の基本原理は、点光源を使用して標本を照射し、焦点面上に明確に定義された小さなスポットを形成することです。照射後にスポットから発せられた蛍光は、対物レンズによって収集され、元の照射経路に沿って双方向カラーミラーで構成される分光光度計に送り返されます。分光光度計は蛍光を検出器に直接送ります。光源と検出器の前に 2 つのピンホールがあり、それぞれ照明ピンホールと検出ピンホールと呼ばれます。 2 つの幾何学的寸法は一貫しており、約 100-200nm です。焦点面上の光点と比較すると、この 2 つは共役です。これは、光点が一連のレンズを通過し、最終的に照明ピンホールと検出ピンホールの両方に同時に焦点を結ぶことができることを意味します。このようにして、焦点面からの光は検出穴の範囲内に収束しますが、焦点面の上または下からの散乱光は検出穴の外側でブロックされ、画像化できません。レーザーでサンプルを点ごとに走査することにより、ピンホールを検出した後の光電子増倍管も、対応する光の点ごとの共焦点画像を取得し、デジタル信号に変換されてコンピューターに送信されます。最後に、焦点面全体の鮮明な共焦点画像が画面上に合成されます。
各焦点面の画像は実際には試料の光学断面であり、常に一定の厚さを持ち、光学薄片とも呼ばれます。焦点での光強度は非焦点での光強度よりもはるかに大きく、非焦点面の光はピンホールによって除去されるため、共焦点システムの被写界深度はほぼゼロになります。 Z 軸方向に沿って走査することで、観察サンプルの焦点に 2 次元の光学スライスを形成する光トモグラフィーを実現できます。 XY面（焦点面）走査とZ軸（光軸）走査を組み合わせることにより、二次元画像の連続層を蓄積し、専用のコンピュータソフトウェアで処理することにより、試料の三次元画像を得ることができます。
検出ピンホールと光源ピンホールは常に同じ点に焦点を結ぶため、焦点面の外側で励起された蛍光は検出ピンホールに入ることはできません。
レーザー共焦点顕微鏡の動作原理を簡単に表現すると、光源としてレーザーを使用し、従来の蛍光顕微鏡イメージングに基づいてレーザー走査デバイスと共役集束デバイスが追加されるということです。これは、デジタル画像の取得と処理を行うためにコンピューターによって制御されるシステムです。
