現代顕微鏡の概念をミクロ世界の観察に応用
古代から現代に至るまで、人類はより高く、より遠い真理を追い求めてきました。 大洋航海から宇宙探査まで、人々は次々と壮大な目標を達成してきました。 しかし、人間が肉眼で見ているマクロな世界がすべてではなく、人間の目でははっきりと見ることはできません。 また、無数の人々を魅了し、探求し、追求します。
巨視的、微視的を問わず、私たちの観察は三次元空間、つまりXYZ三次元の属性に基づいており、物の形状の変化の観察には時間Tという別の測定要素を導入する必要があるため、物事を観察するための最も完全な方法は、XYZT の同時記録、つまり、形状と時間の長期撮影である必要があり、これも顕微鏡の究極の機能です。
300 年以上の発展を経て、現代の顕微鏡は解像度、被写界深度、視野などの概念を提案し、解決策を提案し続けてきました。 顕微鏡は当初、ミクロの世界を観察するという私たちのニーズを満たし、ミクロの世界の時空を記録するのに役立ちました。
ミクロの世界の観察において最も重要なことは細部の解像度であり、そこから解像度という概念が生まれました。 解像度とは、人間の目で識別できる 2 点間の最小距離を指し、XY 次元でのみ有効です。 レイリー基準である Rayleigh Criterion によると、普通の人が識別できる限界は 25cm 離れたところにある 0.2mm の 2 点です。 顕微鏡を使用すると、より短い距離にある 2 つの点を見ることができるため、観察の解像度が向上します。 現代の研究が継続的に深化するにつれて、解像度に対する人々の要求も常に高まっており、科学者も顕微鏡の解像度を常に向上させています。 例えば、電子顕微鏡は分解能がナノメートルレベルまで向上し、ウイルスの観察が可能になりました。 超高顕微イメージング技術により、顕微鏡の解像度が200ナノメートルから数十ナノメートルに向上し、生きた細胞小器官の観察が実現します。
解像度の向上により、視野角や被写界深度が狭くなるという新たな問題も生じます。 通常の中心照明法（標本に光を均一に通す明所視照明法）を使用した場合、顕微鏡の分解能距離はd=0.61 λ/NA、可視光の波長範囲は{ {2}}nm、平均波長は 550nm であり、波長は固定定数です。 したがって、NA 値を大きくすると、D 値、つまり識別できる 2 点間の距離が小さくなり、より小さな物体をはっきりと見ることができるようになります。
NA 値は開口数であり、レンズの受光円錐角のサイズを表します。NA=n * sin 、つまり、レンズとレンズの間の媒質の屈折率 (n) の積です。検査対象物と開口角の半分の正弦 (2)。 nは対物レンズとサンプルの間の媒質の光の屈折率です。 顕微鏡の物体空間媒体が空気の場合、屈折率 n=1。 空気よりも屈折率の高い媒体を使用すると、NA 値を大幅に高めることができます。 水浸媒体は蒸留水であり、屈折率の比は 1.33 です。 油浸対物媒質は杉油などの透明な油であり、その屈折率は一般に1.52程度で、レンズやスライドガラスの屈折率に近い。 したがって、オイルレンズのＮＡ値は空気レンズのＮＡ値よりも高くなる。
「ミラー口角」としても知られる開口角は、レンズの光軸上の物点と対物レンズの前玉の有効直径によって形成される角度です。 鏡の口の角度を大きくすると正弦値が大きくなる可能性があり、実際の上限は約 72 度 (正弦値は 0.95) であり、これに杉油の屈折率 1.52 を乗算すると、 NA の最大値は約 1.45 であり、分解能計算式に代入すると、従来の顕微鏡の XY 面分解能の限界は 0.2um 程度であることがわかります。
NA 値は、顕微鏡の視野 (B) の明るさにも直接影響します。 式 B∝NA2/M2 から、開口数 (NA) が増加するか、対物レンズ倍率 (M) が減少すると、明るさが増加することが推測できます。
理論的には、より優れた XY 平面解像度と視野の明るさを得るために、可能な限り高い NA 値を追求する必要があります。 しかし、すべてのものには両面があります。 XY平面解像度の向上により、Z軸の被写界深度や観察視野が狭くなります。
顕微鏡は通常、垂直下向きに観察します。 視野の直径内で観察される物体の表面の凸位置と凹位置がはっきりと見えるとき、その凸点と凹点の高低差が被写界深度になります。 そうですね、顕微鏡の場合、被写界深度は深いほど良いのです。 被写界深度が深いほど、凹凸のある物体の表面を観察する際に、より鮮明で立体的な画像を得ることができます。 被写界深度が深いため、垂直方向のミクロの世界を観察することができます。 つまり、XYZ三次元形式のZ軸情報です。
被写界深度は、像面上の鮮明な画像に対応する前後空間の深さです: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M*NA) * e、dtot: 被写界深度NA: 開口数、M: 総合倍率、λ: 光の波長、(通常は λ=0.55um)、n: サンプルと対物レンズの間の媒質の屈折率 (空気: n{{3 }},oil: n=1.52) この式によれば、Z 軸の被写界深度は XY 平面の NA 値に反比例することが分かります。
被写界深度に加えて、視野も NA 値の影響を受けます。 機器が一点を固定して見ているときに見える空間範囲が視野です。 その計算は対物レンズの倍率に直接関係します。 観察で見える実際の視野の直径は、視野の直径を対物レンズの倍率で割ったものに等しく、接眼レンズは 10/18 などの対応する視野を示します。倍率は10倍、視野径は18mmです。 したがって、接眼レンズを決めると倍率が大きくなるほど観察視野は狭くなります。
XY 平面の解像度は局所的な詳細の分析であり、視野はサンプルの観察範囲を決定します。 視野は大きいほど良いのですが、現在の技術では制限があり、良好な NA 値を得るには高倍率の対物レンズを使用する必要があるため、視野と NA 値には間接的な負の相関関係があります。
