微生物数の測定 - 顕微鏡の直接計数法！
細菌集団の増殖は、細胞数の増加または細胞質量の増加によって明らかになります。 細胞数の測定方法には、直接顕微鏡計数法、プレートコロニー計数法、光電油比法、最大確率法、膜ろ過法などがあります。 細胞物質を測定する方法には、細胞の乾燥重量の測定、窒素、RNA および DNA 含有量などの特定の細胞成分の測定、および代謝産物の測定が含まれます。 つまり、微生物の増殖を測定する方法は数多くあり、それぞれに長所と短所があり、特定の状況に応じて選択する必要があります。 この実験では、生産や科学研究で一般的に使用される顕微鏡直接計数法を主に紹介します。
1. 目的要件
1. 血球数の原理を明らかにする。
2. 血球計数器による微生物の数え方をマスターする。
2. 基本原則
顕微鏡直接計数法は、特定の面積と体積を持つ特殊なガラス スライド (細菌カウンターとも呼ばれます) でテストするサンプルの少量の懸濁液を直接計数する、シンプルで迅速かつ直感的な方法です。 メソッド。 現在、国内外で一般的に使用されている細菌カウンターは、血球計数盤、ピーターオフハウザー細菌カウンター、ホークスリー細菌カウンターなどです。これらは、酵母、細菌、カビの胞子およびその他の懸濁液のカウントに使用できます。基本原理は同じです。 後者の 2 種類のバクテリア カウンターは、カバー ガラスで覆われた後の総体積が 0.02mm3 で、カバー ガラスとスライド間の距離はわずか 0.02mm であるため、オイル液浸対物レンズは、細菌などの小さな細胞を観察して観察するために使用できます。 カウント。 これらの細菌計以外にも、牛乳の細菌検査で一般的に用いられている、顕微鏡直下で観察した視野の面積に対する塗抹標本の面積の比率を推定する方法もあります。 顕微鏡直接計数法の利点は、直感的で、迅速で、操作が簡単です。 ただし、この方法の欠点は、通常、測定結果が死細胞と生細胞の合計になることです。 現在、この欠点を克服する方法として、マイクロチャンバー培養 (短時間) を染色する生菌の組み合わせや、生菌のみをカウントする目的を達成するための細胞分裂阻害剤の添加などがあります。
この実験では、血球計を直接顕微鏡計数の例として使用しました。 他の 2 種類の細菌カウンターの使用については、各メーカーの説明書を参照してください。 血球計を使用して顕微鏡下で直接計数することは、微生物を計数するために一般的に使用される方法です。 カウント プレートは、4 つのスロットによって 3 つのプラットフォームが形成される特殊なガラス スライドです。 中央の広いプラットフォームは、短い横スロットによって 2 つの半分に分割され、プラットフォームの両側にグリッドがあります。 各グリッドは 9 つの大きな正方形に分割され、中央の大きな正方形はカウント ルームです。 血球計数プレートの構造を図1{{{{10}}}}に示します。 計数室のスケールには一般に 2 つの仕様があります。1 つは大きな正方形が 25 の中央の正方形に分割され、各中央の正方形は 16 の小さな正方形に分割されています (図 15-2)。 もう1つは大きな正方形です。 正方形は 16 個の中の正方形に分割され、各中の正方形は 25 個の小さな正方形に分割されますが、どのようなカウント ボードであっても、各大きな正方形には 400 個の小さな正方形があります。 大きな正方形の一辺の長さは 1mm、大きな正方形の面積は 1mm2 です。 カバーガラスをかぶせた後のカバーガラスとスライドガラスの高さは0.1mmなので計数室の容積は0.1mm3（1000分の1ミリリットル）です。 図15-1 血球計数盤の構造 (1) 図15-2 血球計数盤の構造 (2) A. 正面図; B.縦断面図。 拡大されたグリッド、中央の大きな四角は計数室 1 です。血球計数プレート。 2.カバーガラス; 3. 計数室で計数するときは、通常、5 つの正方形の細菌の総数を数え、各正方形の平均を計算し、25 または 16 を掛けて、大きな正方形の細菌の総数を次のように変換します。 1mlの菌液中の菌の総数。 5マスの総菌数をA、菌液の希釈倍率をBとする。25マスの計数板であれば、菌液1mL中の総菌数{{26} } A/5×25×104×B=50000A・B(個) 同様に、中正方形16枚の計数皿であれば、菌液1mL中の総菌数=A/ 5×16×104×B=32000A・B（個）
3. 設備
1.細菌
サッカロマイセス・セレビシエ
2. 器具またはその他の器具
血球計、顕微鏡、カバースリップ、滅菌キャピラリー スポイト。
4. 操作手順
1. 細菌懸濁液の調製
サッカロミセス・セレビシエは、無菌生理食塩水で適切な濃度の細菌懸濁液に調製した。
2. 顕微鏡計数室
サンプルを追加する前に、計数プレートの計数チャンバーを顕微鏡で検査します。 汚れがある場合は、数える前にきれいにして乾燥させる必要があります。
3. サンプルを追加
清潔で乾燥した血球計をカバースリップで覆い、滅菌キャピラリー スポイトを使用して、カバースリップの端から振ったサッカロマイセス セレビシエ懸濁液の小滴を落とし、細菌溶液をキャピラリー浸透によってギャップに沿って自動的に移動させます。 計数室に入ると、一般的な計数室は細菌液で満たすことができます。 サンプリングするときは、まず細菌溶液を振ってください。 サンプルを追加するとき、計数チャンバー内に気泡が発生してはなりません。
4. 顕微鏡計数
サンプルを追加した後、5 分間静止した後、血球計を顕微鏡ステージに置き、最初に低倍率の顕微鏡で計数室の位置を見つけてから、高倍率の顕微鏡に切り替えて計数します。 顕微鏡ライトの強度を適切に調整します。 照明にミラーを使用する顕微鏡の場合、光が片側から外れないように注意してください。そうしないと、計数室の四角い線が視野にはっきりと見えなかったり、縦線または横線しか見えなくなったりします。見られる。 計数前に菌液の濃度が高すぎたり、希釈しすぎたりしていることが判明した場合は、計数前に希釈を再調整する必要があります。 一般に、サンプルの希釈には、各小さなセルに約 5 ～ 10 の細菌が必要です。 各カウンティング チャンバーは、計数のために 5 つの中間セル (オプションで 4 つのコーナーと中央の 1 つの中間セル) を選択します。 グリッド線上にあるセルは、通常、上と右の線でのみカウントされます。 酵母の出芽の場合、芽の大きさが母細胞の半分に達した時点で、菌体2個として数えます。 サンプルをカウントするには、2 つの計数チャンバーから平均値を計算することにより、サンプルの細菌含有量を計算します。
5. 血球数の洗浄
使用後は血球計数盤を水道の水ですすぎ、硬いものでこすらず、洗った後はご自身で乾かすか、ドライヤーで乾かしてください。 各小さなセルに残留細菌やその他の沈殿物があるかどうかを観察するための顕微鏡検査。 汚れている場合は、きれいになるまで繰り返し洗浄する必要があります。
