蛍光顕微鏡と通常の顕微鏡の違い
1.照明方法を見る
蛍光顕微鏡の照明方式は一般的にエピ方式、つまり対物レンズを通して試料に光源を当てる方式です。
2.解像度を見る
蛍光顕微鏡は、比較的波長の短い紫外光を光源に使用しますが、分解能は通常の光学顕微鏡よりも高くなります。
3、フィルターの違い
蛍光顕微鏡は、光源の前に使用して可視光を除去し、対物レンズと接眼レンズの間に使用して人間の目を保護できる紫外線を除去する 2 つの特殊なフィルターを使用します。
蛍光顕微鏡も光学顕微鏡の一種ですが、主に蛍光顕微鏡で励起される波長が短いため、蛍光顕微鏡と通常の顕微鏡の構造や用途の違いにつながります。 ほとんどの蛍光顕微鏡は、弱い光を捉える優れた機能を備えています。 、非常に弱い蛍光の下で、そのイメージング能力も良好です。 近年の蛍光顕微鏡の継続的な改善と相まって、ノイズも大幅に減少しました。 そのため、ますます多くの蛍光顕微鏡が使用されています。
二光子蛍光顕微鏡の知識
2 光子励起の基本原理は次のとおりです。高光子密度の場合、蛍光分子は 2 つの長波長の光子を同時に吸収し、いわゆる励起状態の非常に短い寿命の後、短波長の光子を放出します。 ; この効果は、長波長の半分の波長を持つ光子を使用して蛍光分子を励起するのと同じです。 2 光子励起には高い光子密度が必要であり、細胞を損傷しないようにするために、2 光子顕微鏡では高エネルギー モード同期パルス レーザーが使用されます。 このレーザーは、パルス幅わずか100フェムト秒、周波数80～100MHzで、ピークエネルギーが高く、平均エネルギーが低いレーザー光を出射します。 高開口数対物レンズを使用してパルスレーザーの光子を集束させると、対物レンズの焦点での光子密度が最も高くなり、対物レンズの焦点でのみ 2 光子励起が発生します。そのため、2 光子顕微鏡は共焦点ピンホールを必要とせず、蛍光検出効率が向上します。
一般的な蛍光現象では、励起光の光子密度が低いため、蛍光分子は同時に 1 つの光子しか吸収できず、放射遷移によって蛍光光子を放出します。これを単一光子蛍光と呼びます。 光源としてレーザーを使用した蛍光励起プロセスでは、2 光子または多光子の蛍光現象が発生する場合があります。 このとき、使用する励起光源の強度は高く、光子密度は、蛍光分子が 2 つの光子を同時に吸収するという要件を満たしています。 一般的なレーザーを励起光源として使用するプロセスでは、光子密度はまだ2光子吸収を生成するのに十分ではありません。 通常はフェムト秒パルスレーザーが使われ、その瞬間出力はメガワット級に達する。 したがって、２光子蛍光の波長は励起光の波長よりも短く、半励起波長励起による効果と同等である。
二光子蛍光顕微鏡には多くの利点があります。
1) 長波長の光は短波長の光に比べて散乱の影響を受けにくく、試料を透過しやすい。
2) 焦点面の外側の蛍光分子は励起されないため、より多くの励起光が焦点面に到達し、励起光がより深い標本に浸透することができます。
3) 長波長の近赤外光は、短波長の光よりも細胞への毒性が低い。
4) 2 光子顕微鏡で標本を観察すると、光退色と光毒性は焦点面にのみ存在します。 したがって、2 光子顕微鏡法は、単一光子顕微鏡法よりも厚い標本の観察、生細胞の観察、または定点光退色実験の実施に適しています。
共焦点蛍光顕微鏡の知識
共焦点蛍光顕微鏡の基本原理: 点光源を使用して試料を照らすと、焦点面に明確な輪郭を持つ小さな光スポットが形成されます。 ビームスプリッターで構成されています。 ビームスプリッターは、蛍光を検出器に直接送ります。 光源と検出器の前にピンホールがあり、それぞれ照明ピンホールと検出ピンホールと呼ばれます。 2つの幾何学的寸法は同じで、約100-200 nmです。 つまり、光スポットは一連のレンズを通過し、最終的に照明ピンホールと検出ピンホールに同時に焦点を合わせることができます。 このようにして、焦点面からの光は検出孔の範囲内に集中することができるが、焦点面の上または下からの散乱光は検出孔から遮断され、画像化することができない。 サンプルはレーザーでポイントごとにスキャンされ、ピンホールを検出した後、光電子増倍管も対応する光のポイントごとの共焦点画像を取得し、デジタル信号に変換してコンピューターに送信し、最終的に集約します画面を焦点面全体の鮮明な共焦点画像にします。 .
各焦点面の画像は、実際には試料の光学断面であり、この光学断面には常に一定の厚さがあり、光学スライスとも呼ばれます。 焦点での光強度は非焦点での光強度よりもはるかに大きく、非焦点面の光はピンホールによって除去されるため、共焦点システムの被写界深度はほぼゼロであり、 Z 軸は光トモグラフィーを実現し、サンプルの集光スポットで 2 次元の光学セクションを観察します。 XY 平面（焦点面）スキャンと Z 軸（光軸）スキャンを組み合わせて、連続する層の 2 次元画像を蓄積し、専用のコンピューター ソフトウェアで処理することにより、サンプルの 3 次元画像を取得できます。
すなわち、検出ピンホールと光源ピンホールは常に同じ点に焦点が合っているため、焦点面外で励起された蛍光は検出ピンホールに入ることができない。
共焦点レーザーの動作原理の簡単な表現は、光源としてレーザーを使用し、従来の蛍光顕微鏡イメージングに基づいて、レーザー走査装置と共役焦点装置が取り付けられ、デジタル画像の取得と処理です。システムはコンピュータによって制御されます。
