共焦点蛍光顕微鏡の知識

共焦点蛍光顕微鏡の知識

共焦点蛍光顕微鏡法の基本原理: 点光源を使用して標本を照射し、焦点面に小さく明確な光点を形成します。照射後にこの点から放出された蛍光は対物レンズによって収集され、元の照射光路に沿って双方向色彩ミラーで構成されるビームスプリッターに送り返されます。ビームスプリッターは蛍光を直接検出器に送ります。光源と検出器の両方の前には、それぞれ照明ピンホールと検出ピンホールと呼ばれるピンホールがあります。どちらも約 100-200 nm の同じ形状で、焦点面上の光点に関して共役です。つまり、光点は一連のレンズを通過し、最終的に照明ピンホールと検出器ピンホールの両方に焦点を合わせることができます。このようにして、焦点面からの光はプローブ開口部内で収束できますが、焦点面の上または下からの散乱光はプローブ開口部の外側でブロックされ、画像化できません。 レーザーはサンプルを点ごとにスキャンし、光電子増倍管はピンホールを検出した後、対応する光点の共焦点画像を点ごとに取得します。この画像はデジタル信号に変換されてコンピューターに送信され、最終的に画面上に焦点面全体の鮮明な共焦点画像に収束します。

各焦点面画像は、実際には試料の光学断面であり、この光学断面には常に一定の厚さがあり、光学シートとも呼ばれます。焦点の光強度は非焦点の光強度よりもはるかに大きく、非焦点面の光はピンホールによってフィルタリングされるため、共焦点システムの被写界深度はゼロに近似され、Z軸方向に沿ってスキャンすることで、光トモグラフィーによって焦点で観察される試料の2次元光学スライスを形成できます。XY平面（焦点面）スキャンとZ軸（光軸）スキャンを組み合わせると、専用のコンピューターソフトウェアで処理された2次元画像の連続レイヤーを蓄積することで、サンプルの3次元画像を取得できます。
これは、検出ピンホールと光源ピンホールが常に同じ点に焦点を合わせることを意味し、焦点面の外側で励起された蛍光は検出ピンホールに入ることができません。

レーザー共焦点の動作原理を簡単に説明すると、レーザーを光源として使用し、従来の蛍光顕微鏡画像に基づいて、レーザー走査装置と共役焦点装置を追加し、コンピューター制御を介してデジタル画像取得および処理システムを実行します。