レーザー共焦点顕微鏡 - 特徴と用途

レーザー共焦点顕微鏡 - 特徴と用途

レーザー走査共焦点顕微鏡 (LSCM) は、共役焦点技術に基づいて設計された顕微鏡の一種です。つまり、レーザー光源、測定対象のサンプル、および検出器はすべて互いに共役な位置にあります。

基本的
一般的な顕微鏡では、対物レンズの焦点面を検出器と一致させることにより、観察像面が隣接する軸面から分離されますが、共焦点顕微鏡では、回折限界の光スポットを使用してサンプルを照らし、光スポットの共役焦点にある収集光路にピンホールを使用して迷光をフィルタリングし、この分離効果を生み出して解像度を向上させます。

イメージング機能

光学断面スキャン画像
レーザー走査共焦点顕微鏡のもう一つの特徴は、走査型イメージング技術であることです。従来の広視野照明技術ではサンプル全体を照らすため、肉眼または検出器で直接画像を撮影できますが、LSCM では 1 本のビームまたは複数の集束ビームを使用してサンプルを通過し、スキャンして画像化します。得られた画像は光学セクションと呼ばれます。以下は、従来の広視野照明法とレーザー走査共焦点照明法の違いを示しています。

そのため、現代の共焦点顕微鏡の実際の動作方法は、下図のようになります。レーザーから放出された励起光は、ダイクロイックミラーを通過し、一対のガルバノメータを介してサンプルのx方向とy方向にスキャンされます。サンプルの励起（または反射）光はピンホールを介してPMT検出器に入り、記録され、記録されたスキャン画像はコンピューターによって再構成され、実際のサンプル画像を再構成します。

異なる焦点面で「Zスタック」画像を生成する
共役サンプル層から反射された光だけが、収集光路の小さな穴を通過でき、残りの無関係なサンプル層の反射は、小さな穴によってブロックされます。これにより、解像度が大幅に向上します。同じ厚いサンプルの多次元蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡を並べて比較します。一連の画像が異なる焦点面で撮影されると、一般に「Z スタック」と呼ばれる画像が生成されます。これは、共焦点顕微鏡によって提供される解像度とコントラストの向上と、これらの向上の根本的な原因を示しています。スタックの上部にある画像を組織の上にイメージング面を配置して調べると、蛍光画像に大量の散乱光があることがわかりますが、共焦点顕微鏡画像は黒く見えることがわかります。この軸方向 PSF の減少は、Z スタックの中央の光学インターフェイスで観察される解像度の違いに直接つながります。

ワイドフィールド照明に比べて解像度が大幅に向上
蛍光顕微鏡では、一点から放射される光の強度は点像分布関数（PSF）で表され、そのパターンはエアリーディスクとなる。蛍光システムの解像度はエアリーディスクの半径で表すことができ、これは対物レンズの開口数と励起光の波長によって決まる。