微生物の染色技術と顕微鏡観察
1。目的
1.1 微生物塗抹標本と染色の基本的な技術を学びます。
1.2 細菌の簡単な染色法をマスターする。
1.3 細菌の形態学的特徴を予備的に理解し、オイルレンズの使用方法と無菌操作技術に関する知識を強化する。
2 原則
細菌の塗抹染色は、微生物学実験の基本的な技術です。細菌細胞は小さくて透明なので、通常の光学顕微鏡では識別が難しく、染色する必要があります。細菌を染色するには単一の染料を使用するため、染色された細菌は背景と明確な色の違いを形成し、その形態と構造をより明確に観察できます。この方法は操作が簡単で、細菌細胞の一般的な形状と細菌の配置を観察するのに適しています。塩基性染料は、単純な染色によく使用されます。これは、中性、アルカリ性、または弱酸性の溶液では、細菌細胞は通常負に帯電し、塩基性染料がイオン化されると、分子の染色部分が正に帯電するため、アルカリ性になるためです。染料の染色部分は細菌と簡単に結合して着色します。染色された細菌細胞は背景と鮮明にコントラストをなすため、顕微鏡で識別しやすくなります。 簡易染色によく使われる染料には、メチレンブルー、クリスタルバイオレット、塩基性フクシンなどがあります。細菌が糖を分解して酸を生成し、培地のpHが低下すると、細菌の正電荷が増加します。このとき、エオシン、酸性フクシン、コンゴーレッドなどの酸性染料を染色に使用できます。染色する前に細菌を固定する必要があります。その目的は2つあります。1つは細菌を殺してスライドガラスに付着させることです。もう1つは染料に対する親和性を高めることです。よく使われる2つの方法は、加熱と化学固定です。固定するときは、細胞の元の形状を維持するようにしてください。
3つの材料
3.1 細菌: 枯草菌 12-18 時間寒天斜面培養、黄色ブドウ球菌 24 時間寒天斜面培養、大腸菌 24 時間寒天斜面培養、パン酵母寒天斜面培養。
3.2 染色剤：Luのアルカリメチレンブルー染料（またはシュウ酸アンモニウムクリスタルバイオレット染料）、石炭酸フクシン染料。
3.3 器具またはその他の用具：顕微鏡、アルコールランプ、スライド、接種用ループ、スライドラック、二重層ボトル（シダーオイルとキシレンを含む）、レンズ組織、生理食塩水または蒸留水など。
4. 工程：塗抹→乾燥→固定→染色→洗浄→乾燥→顕微鏡検査。
5つのステップ
5.1 塗抹標本：清潔で油分のないスライドガラスを 2 枚用意します。滅菌状態で、スライドガラスの中央に生理食塩水（または蒸留水）を 1 滴ずつ垂らします。接種用ループを使用して、枯草菌、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌などの細菌を殺菌します。斜面の水滴の中に細菌の芝生を少し取り、よく混ぜて薄い膜状に塗ります。細菌懸濁液（または液体培養）の塗抹標本を使用する場合は、接種用ループを使用して 2 ～ 3 個のループを拾い、スライドに直接塗布します。生理食塩水（蒸留水）を落としすぎて細菌を除去しないように注意し、厚く塗りすぎないようにしてください。
5.2 乾燥 室温で自然乾燥させます。コーティング面を上にしてアルコールランプで軽く加熱して乾燥させることもできます。ただし、温度が高すぎると細菌の形態が破壊されるため、炎に近づきすぎないように注意してください。
5.3 固定 加熱乾燥を使用する場合、固定と乾燥は 1 つのステップにまとめられ、方法は乾燥と同じです。塗布、乾燥、加熱固定します。
5.4 染色: スライドをスライドラックに平らに置き、染色液を 1 ～ 2 滴塗抹標本に滴下します (染色液が塗抹標本フィルムを覆う程度が適切です)。Lu の塩基性メチレンブルーで 1 ～ 2 分間染色し、石炭酸フクシン (またはシュウ酸アンモニウム クリスタル バイオレット) で約 1 分間染色します。
5.5 水で洗浄する: 染色液を流し出し、スライドの片方の端から水道水で、塗抹標本から流れ落ちる水が無色になるまで静かに洗い流します。水で洗浄する際は、塗抹標本の表面を直接水で洗わないでください。塗抹標本のフィルムが剥がれ落ちるのを防ぐため、水流は速すぎたり大きすぎたりしないようにしてください。
5.6 乾燥: スライド上の水滴を振り払い、自然乾燥させるか、ヘアドライヤーで乾かすか、吸収紙で吸い取ります (細菌を拭き取らないように注意してください)。 5.7 顕微鏡検査 塗抹標本が乾燥したら、顕微鏡検査を行います。オイルレンズで観察する前に、塗抹標本は完全に乾燥している必要があります。
6 結果 単一染色後に観察された E. coli と Micrococcus luteus の形態を描きます。
