二光子蛍光顕微鏡とは
二光子励起の基本原理は次のとおりです。光子密度が高い場合、蛍光分子は 2 つの長波長光子を同時に吸収し、いわゆる励起状態の寿命が短い期間の後に短波長の光子を放出します。 。 ; この効果は、長波長の半分の波長を持つ光子を使用して蛍光分子を励起するのと同じです。 二光子励起には高い光子密度が必要です。 細胞に損傷を与えないように、二光子顕微鏡では高エネルギーのモードロックパルスレーザーが使用されます。 このレーザーから放射されるレーザーは、ピークエネルギーが高く、平均エネルギーが低く、パルス幅はわずか100フェムト秒で、周波数は80〜100メガヘルツに達することがあります。 高開口数対物レンズを使用してパルスレーザーの光子を集束させる場合、対物レンズの焦点における光子密度が最も高く、二光子励起は対物レンズの焦点でのみ発生するため、二光子顕微鏡は共焦点ピンホールを必要としないため、蛍光検出効率が向上します。
一般的な蛍光現象では、励起光の光子密度が低いため、蛍光分子は同時に 1 つの光子しか吸収できず、その後放射遷移を通じて蛍光光子を放出します。これが単一光子蛍光です。 光源としてレーザーを使用する蛍光励起プロセスでは、二光子蛍光、さらには多光子蛍光が発生する可能性があります。 このとき、使用される励起光源の強度は高く、光子密度は同時に2つの光子を吸収する蛍光分子の要件を満たします。 一般的なレーザーを励起光源として使用するプロセスでは、二光子吸収現象を引き起こすにはまだ光子密度が十分ではありません。 通常、フェムト秒パルスレーザーが使用され、その瞬間出力はメガワットのオーダーに達することがあります。 したがって、二光子蛍光の波長は励起光の波長よりも短く、励起波長の半分で励起した場合と同等の効果が得られます。
